velikost textu

The study of Xenopus tropicalis testis-derived stem cells

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
The study of Xenopus tropicalis testis-derived stem cells
Název v češtině:
Studium kmenových buněk odvozených z varlat Xenopus tropicalis
Typ:
Disertační práce
Autor:
Thi Minh Xuan Nguyen, M.Sc., Ph.D.
Školitel:
RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D.
Oponenti:
RNDr. Petr Bartůněk, CSc.
Mgr. Mária Hovořáková, Ph.D.
Id práce:
144126
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová a buněčná biologie (P1529)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
7. 6. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
testikulární kmenové buňky, migrace, diferenciace, Xenopus tropicalis
Klíčová slova v angličtině:
testicular stem cells, migration, differentiation, Xenopus tropicalis
Abstrakt:
Studium kmenových buněk odvozených z varlat Nguyen Thi Minh Xuan Xenopus tropicalis Abstrakt Sertoliho buňky (SCs) produkují celou řadu molekul klíčových pro determinaci samčího pohlaví a pro regulaci spermatogeneze v dospělosti. Poruchy diferenciace Sertoliho buněk vedou u člověka ke sterilitě. Před nástupem puberty hrají důležitou roli v udržení spermatogoniálních buněk v kmenovém stavu a zajišťují tak jejich dostatečný počet. Zajímavým znakem odlišujícím nezralé a zralé Sertoliho buňky je dočasná přítomnost cytokeratinu, který byl u těchto buněk popsán u celé řady modelových organismů. V rámci této disertační práce jsme se zabývali rozdílnou genovou expresí proteinů spojených s regulací cytokeratinu u nezralých a zralých Sertoliho buněk odvozených z varlat Drápatky tropické (Xenopus tropicalis). Imunohistochemické řezy varlat z juvenilních jedinců a imunocytochemická analýza buněčné kultury odvozené ze stejného zdroje, obsahující nezralé progenitory Sertoliho a peritubulárních myoidních buněk (XtiSC) ukázaly na společnou expresi cytokeratinu a membránového β-kateninu. V případě vzorku z dospělých jedinců nebyla detekována přítomnost ani jednoho z nich. Dále pak podobný fenotyp vykazovaly i migrující Sertoliho buňky (pre- SCs), které se nacházely mimo semenotvorné kanálky. I zde byla exprese obou proteinů potlačena. Přidání inhibitoru glykogen syntázy kinázy 3, CHIR99021, k buněčné kultuře XtiSC vedlo k dediferenciaci přítomných buněk do kmenového stavu a k rozšíření jejich diferenciačního potenciálu. Role cytokeratinu a dalších proteinů zahrnujících β-katenin a Sox9, marker Sertoliho buněk, na diferenciaci Sertoliho buněk nebyla dosud prozkoumána. V rámci předložené disertační práce jsme se zabývali vztahem mezi cytokeratinem a membránovým β-kateninem včetně příslušných mezibuněčných spojů (cell junctions) u nezralých Sertoliho buněk. Reverzibilní destrukce cytokeratinové sítě pomocí akrylamidu vedla u XtiSC buněk ke ztrátě membránového β-kateninu. F-aktin, β- tubulin nebo proteiny buněčné adheze (kináza fokálních adhezí - FAK a integrin β1) nebyly akrylamidem ovlivněny. Na druhou stranu narušení membránového β-kateninu pomocí Ca 2+ chelatačního činidla EGTA nezpůsobilo vážnější dezintegraci cytokeratinové sítě. Výsledky ukazují na novou roli cytokeratinu pro stabilizaci Studium kmenových buněk odvozených z varlat Nguyen Thi Minh Xuan Xenopus tropicalis mezibuněčných spojů závislých na β-kateninu v nezralých Sertoliho buňkách. Tato stabilizace je klíčová pro udržení spermatogonií ve stavu dělících se buněk bez meiotického zrání v rámci pre-pubertálních varlat a dále pak pro správné formování semenotvorných kanálků. Epitelo-mezenchymální tranzice (EMT) a mezenchymo-epiteliální tranzice (MET) patří mezi základní buněčné procesy v zárodečném vývoji. EMT je charakterizovaná jako přeměna adhezivních buněk epiteliálního typu na mezenchymální typ schopný migrace. MET pak představuje obrácený proces. Nezralé Sertoliho buňky (XtiSC) vykazují mezenchymální fenotyp. Za fyziologických in vivo podmínek musí tyto buňky podstoupit MET a diferencovat se ve zralé Sertoliho buňky. V laboratoři školitele se podařilo založit dlouhodobou buněčnou kulturu odvozenou z varlat juvenilních jedinců X. tropicalis. Expresní profil buněk obsahoval markery nezralých Sertoliho buněk jako Sox9, vimentin, cytokeratin a β-katenin. V první publikaci, která je součástí disertační práce byly tyto buňky zkracovány jako XtTSC (Xenopus tropicalis Testicular Somatic Cells). V dalších dvou rukopisech jsou popisovány jako nezralé Sertoliho buňky, XtiSC (Xenopus tropicalis immature Sertoli Cells). Cílem předložené disertační práce byla identifikace faktorů odpovědných za indukci epitelo-mezenchymální tranzice u XtiSC a nalezení tzv. “kmenového okna” (stemness window), ve kterém buňky vykazují nejširší diferenciační potenciál. K tomuto účelu jsme zvolili GSK-3 inhibitor (CHIR99021) a dále pak FGF2 a/nebo TGF- β1 ligandy. Třídenní ošetření XtiSC buněčné kultury GSK-3 inhibitorem vedlo ke kompletní EMT. FGF2 vedl pouze k částečné tranzici do mezenchymálního fenotypu. Na druhou stranu TGF-β1 měl vliv na senescenci nikoliv na EMT. Působení CHIR99021 bylo patrné jak na úrovni změny buněčné morfologie (vřetenovitý tvar buněk), ale také na zvýšené expresi mezenchymálních proteinů jako je fibronektin, integrin α5β1, Snai1 a Zeb1 a na snížené expresi epiteliálního markeru, cytokeratinu. Navíc ošetření buněk GSK-3 inhibitorem vedlo ke zvýšení markerů typických pro kmenové buňky, jako např. Sox2 a cd44. To mělo za následek schopnost XtiSC diferencovat do chondrocytů in vitro a kardiomyocytů in vivo po jejich mikroinjekci do peritoneálního prostoru pulců X. tropicalis. XtiSC buňky po EMT tranzici migrovaly k nádorovým buňkám cervikálního karcinomu a do místa po Studium kmenových buněk odvozených z varlat Nguyen Thi Minh Xuan Xenopus tropicalis indukovaném poranění. Výsledky této disertační práce umožní lepší pochopení mezibuněčné signalizace, která stojí za přípravou kmenových buněk odvozených z varlat. Navíc XtiSC buňky představují nový model pro studium epitelo-mezenchymální tranzice v rámci zrání Sertoliho buněk a spermatogeneze.
Abstract v angličtině:
The study of Xenopus tropicalis testis-derived stem cells Nguyen Thi Minh Xuan Abstract The substances secreted by Sertoli cells (SCs) are crucial to determine male sex characteristics in embryos and regulate spermatogenesis in adulthood. The failure in SC maturation can cause sterility in men. Before puberty, SCs keep the ability to proliferate and have been considered as immature cells. They differ remarkably from mature cells in connection with their morphology and biochemical activity and thus they probably play a part in maintaining spermatogonia stem cells in an undifferentiated stage. The transient presence of cytokeratin in immature SCs has been reported in many species, but not in Xenopus yet. We investigated which molecules are expressing only in immature Sertoli cells of X. tropicalis testes. The regulation of cytokeratin and β-catenin was revealed by fluorescent immunostaining. Cytokeratin and membrane β-catenin co- expressed in X.tropicalis juvenile testes and in cultured SC progenitors, called XtiSCs, but they were absent in adulthood. There was no signal of cytokeratin in migrating SCs (pre-SCs) located outside the seminiferous tubules. The suppression of cytokeratin along with the breakdown of β-catenin-based cell contacts have been observed in XtiSCs after the treatment with a small molecule drug, CHIR99021 and led to their dedifferentiation back to stem cell-like state. These findings confirm the expression of cytokeratin and a novel molecule, β-catenin along with Sox9 in SCs as markers indicating their immature state. However, the function of CK in SC development is poorly understood. We examined interconnection between CK and β-catenin-based cell junctions in immature SCs. Reversible dissociation of CK by acrylamide in XtiSCs induced breakdown of membrane-bound β-catenin but had no effect on F-actin and β-tubulin or cell adhesion proteins (focal adhesion kinase and integrin β1). On the contrary, disruption of membrane β-catenin via uncoupling of cadherins with Ca2+ by chelator EGTA didn’t show any influence on the cytokeratin stability. The results suggest a new role of CK in the retention of β-catenin-based junctions in immature Sertoli cells, and thus serving as structural support for arrested germ cells and for the formation of proper seminiferous tubules. The study of Xenopus tropicalis testis-derived stem cells Nguyen Thi Minh Xuan Epithelial-mesenchymal transition (EMT) and mesenchymal-epithelial transition (MET) are fundamental processes in embryonic development. In general, EMT is characterized by the conversion of sessile epithelial cells into mesenchymal cells with the migratory potential, whereas MET activates a reverse process. A mesenchymal phenotype of pre-Sertoli cells has been observed suggesting that pre-SCs must undergo a MET to differentiate into mature cells. Our laboratory has been successful in the establishment of Xenopus tropicalis somatic cell line from testes of juvenile frogs, called XtTSCs. The isolated cells possessed characteristics of Sertoli cells with expression of immature markers including Sox9, vimentin, cytokeratin and β-catenin, so latter called XtiSCs. The main aim of my Ph.D. project was the determination of factors responsible for the induction of EMT, a reverse differentiation process of SCs, and identification of a stemness window where cells possess the greatest differentiation potential in XtiSCs. GSK-3 inhibitor (CHIR99021), FGF2 and/or TGF-β1 ligands were employed in XtiSCs culture to induce EMT. Our results showed that XtiSCs underwent full EMT after 3-day treatment with GSK-3 inhibitor and partial EMT with FGF2, but not with TGF-beta 1. The morphology change of CHIR-treated XtiSCs to the typical spindle-like cell shape was associated with the upregulation of mesenchymal proteins (fibronectin, integrin α5β1, Snai1 and Zeb1) and low expression of the epithelial marker, cytokeratin. Moreover, this inhibitor also promoted stem cells markers (Sox2, cd44) and the efficient derivation of stem cells from Xenopus testes. CHIR-treated, but not FGF2-treated or vehicle XtiSCs can differentiate into chondrocytes in vitro and cardiomyocytes in vivo after their microinjection into the peritoneal cavity of X. tropicalis tadpoles. Interestingly, the EMT-shifted cells could migrate toward cervical cancer cells in vitro (HeLa cells) and to the injury site in vivo. In general, our results provide a better understanding of signaling pathways underlying the generation of testis-derived stem cells. Moreover, XtiSCs could represent a novel model for the study of the EMT process and SC maturation.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Thi Minh Xuan Nguyen, M.Sc., Ph.D. 13.7 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Thi Minh Xuan Nguyen, M.Sc., Ph.D. 151 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Thi Minh Xuan Nguyen, M.Sc., Ph.D. 146 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Thi Minh Xuan Nguyen, M.Sc., Ph.D. 180 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Petr Bartůněk, CSc. 533 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Mária Hovořáková, Ph.D. 842 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 440 kB