velikost textu

Vliv strukturních a farmakologických determinant na proces otevírání kanálu NMDA receptoru

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Vliv strukturních a farmakologických determinant na proces otevírání kanálu NMDA receptoru
Název v angličtině:
Structural and pharmacological determinants of NMDA receptor channel gating
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Marek Ladislav
Školitel:
RNDr. Jan Krůšek, CSc.
Oponenti:
RNDr. Zdeňka Bendová, Ph.D.
RNDr. Hana Zemková, CSc.
Konzultant:
MUDr. Ladislav Vyklický, DrSc.
Id práce:
144096
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyziologie (31-152)
Program studia:
Fyziologie živočichů (P1521)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
14. 12. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
glutamátové receptory, struktura, funkce, farmakologie
Klíčová slova v angličtině:
glutamate receptors, structure, function, pharmacology
Abstrakt:
Abstrakt N-metyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou heterotetramery, složené ze dvou obligatorních glycin-vázajících GluN1 podjednotek a dvou glutamát/glycin vázajících GluN2/3 podjednotek. Tyto receptory zprostředkovávají rychlý synaptický přenos v centrální nervové soustavě, přičemž hrají výraznou roli při vývoji mozku a synaptické plasticitě, která je základním mechanismem procesu učení a paměti. Bylo prokázáno, že dysfunkce NMDA receptorů je spjata s několika neurologickými a psychiatrickými poruchami. NMDA receptory mají specifickou doménovou organizaci. Extracelulárně nejvzdáleněji od membrány se nachází amino-terminální doména, na kterou směrem k membráně navazuje ligand vázající doména (LBD), kde se vážou agonisté. LBD je propojena třemi krátkými polypeptidovými řetězci – linkery s transmembránovou doménou (TMD), kde se nachází vlastní iontový kanál. Receptor je na intracelulární straně zakončen karboxy-terminální doménou. Proces otevírání iontového kanálu NMDA receptoru zahrnuje několik kroků a je založen na funkčním propojení mezi LBD-linkery-TMD, kdy navázáním agonistů do LBD dochází ke konformační změně, jejíž energie je přenášena linkery na TMD, čímž dochází k otevření iontového kanálu. Detaily tohoto přenosu nejsou stále zcela charakterizovány, i když přesná znalost mechanismu otevírání iontového kanálu NMDA receptoru je základním předpokladem pro pochopení jejich fyziologické funkce. V této práci jsme se zaměřili na strukturní a farmakologické detaily tohoto procesu. Pomocí mutační a následné elektrofyziologické analýzy jsme zkoumali úlohu jednotlivých středových M3-S2 linkerů, které propojují pohyblivý spodní segment LBD (S2) a iontový kanál tvořený M3 helixy TMD. Pomocí bodových záměn za glycinová residua jsme následně posuzovali vliv jednotlivých aminokyselin v rámci M3-S2 linkerů. Zjistili jsme, že iniciální segmenty M3-S2 linkerů v těsné blízkosti TMD (GluN1(LVL) a GluN2(MIQ)) ovlivňují proces otevírání iontového kanálu NMDA receptoru, přičemž důležitou úlohu mají především GluN1(L657) a GluN2B(I655) aminokyseliny. Vedle M3-S2 linkerů jsme testovali také vliv de novo mutací v TMD lidské GluN2B podjednotky, které byly identifikovány u osob s mentální retardací. Z výsledků je patrné, že mutace v této oblasti mají zásadní vliv na fyziologickou funkci NMDA receptoru, což se projevuje buď úplnou ztrátou funkce, nebo snížením povrchové exprese, amplitudy agonistou-evokovaného proudu, či pravděpodobnosti otevření. Pozorovali jsme rovněž změnu v desenzitizaci či afinitě k agonistům. Tyto, převážně negativní, projevy mutací na funkci NMDA receptoru jsme byli schopni farmakologicky plně kompenzovat pomocí steroidní látky, androst-5-en-3β-yl hemisukcinátu, což dává této látce potenciál pro její případné využití v personalizované medicíně. V neposlední řadě jsme zkoumali úlohu D kruhu u steroidních látek a jeho význam pro inhibici NMDA receptoru. Z elektrofyziologických měření perhydrofenantrenových analogů, které zachovávají uspořádaní ABC kruhů steroidních látek, je patrné, že i po rozrušení D kruhu si látky zachovávají inhibiční charakter. Dané výsledky vedly k získání nových strukturních a farmakologických poznatků, které zásadním způsobem přispívají k porozumění procesu otevírání iontového kanálu NMDA receptoru.
Abstract v angličtině:
Abstract N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) are heterotetramers containing two obligatory glycine-binding (GluN1) and two glutamate/glycine-binding (GluN2/3) subunits. These receptors mediate excitatory synaptic transmission in the central nervous system and play a key role in high order neuronal processes as a learning and formation of memory. It has been shown that dysregulation of NMDARs is involved in the pathophysiology of neurological and psychiatric disorders. Each receptor is composed of four protomers exhibiting a conserved domain organization. The most distal part to the cell membrane is the amino-terminal domain that is linked to the ligand binding domain (LBD), which is connected to the pore-forming transmembrane domain (TMD) communicating with the intracellular carboxy-terminal domain. LBD and TMD are connected via three polypeptide chains – linkers. Channel opening is the key step in the NMDAR gating that allows the flux of ions across the membrane. The energy of agonist binding-evoked conformational changes is transferred via linkers to M3 helices forming an ion channel. The rearrangement of M3 helices in activated receptor makes the central cavity of the channel accessible. The details of energy transfer are not yet fully characterized, although accurate knowledge of the receptor gating is a key step for understanding the physiological function of NMDAR. Here, we focused on the structural and pharmacological details of NMDAR channel gating. To answer the fundamental question, what are the initial steps in NMDAR channel opening, we embarked on functional and molecular biology studies of GluN1/GluN2B receptors and focused on the M3 and initial segments of the M3-S2 linkers. Using deletion/glycine mutations, we found that the initial segments of the M3-S2 linkers in close proximity of TMD (GluN1 (LVL) and GluN2 (MIQ)) affect NMDAR channel gating, specifically GluN1 (L657) and GluN2B (I655) residues. In addition, we tested the effect of de novo mutations associated with mental disabilities in the TMD of human GluN2B. The results showed that mutations had a complete or partial loss-of-function effect. Mutations reduced surface expression, amplitude, and the probability of opening. Moreover, changes in desensitization or agonist-affinity were observed. Pharmacologically, we were able to fully compensate loss-of-function effect observed in hGluN2B(L825V) by androst-5-ene-3β-yl hemisuccinate. This substance has a potential for its use in human medicine. Last but not least, we report a structure-activity relationship study for perhydrophenanthrenes analogs focusing on the evaluation of the role of the steroidal D-ring in the inhibition of NMDAR. Electrophysiological approach showed that compounds retained an inhibitory character after the D-ring breakdown. All results revealed new structural and pharmacological details that take place during the NMDAR channel gating.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Marek Ladislav 7.3 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Marek Ladislav 21.39 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Marek Ladislav 222 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Marek Ladislav 220 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Marek Ladislav 3.4 MB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Zdeňka Bendová, Ph.D. 90 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Hana Zemková, CSc. 458 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 122 kB