velikost textu

DNA damage-inducible protein: interakce s proteinovými partnery a potenciální role v proteasomální degradaci proteinů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
DNA damage-inducible protein: interakce s proteinovými partnery a potenciální role v proteasomální degradaci proteinů
Název v angličtině:
DNA damage-inducible protein: interaction partners and potential role in proteasomal degradation
Typ:
Bakalářská práce
Autor:
Bc. Jan Belza
Vedoucí:
Mgr. Klára Grantz Šašková, Ph.D.
Oponent:
RNDr. Ondřej Vaněk, Ph.D.
Id práce:
141777
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (B1406)
Obor studia:
Biochemie (BBIO)
Přidělovaný titul:
Bc.
Datum obhajoby:
5. 9. 2016
Výsledek obhajoby:
Velmi dobře
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
poruchy DNA, protein-proteinové interakce, proteasomální degradace
Klíčová slova v angličtině:
DNA-damage, protein-protein interactions, proteasomal degradation
Abstrakt:
ABSTRAKT Proteiny podobné Ddi1 ( z angl. „DNA damage-inducible proteins“) byly zatím nejlépe charakterisovány v kvasince (protein Ddi1 ze Saccharomyces cerevisiae), v octomilce (protein Rngo z D. melanogaster) a nedávno i v člověku (protein Ddi2). Podle své doménové architektury jsou přiřazovány k proteasomálním adaptorovým proteinům, jejichž funkcí je dopravovat ubikvitinylované substráty k degradaci do proteasomu. Obsahují totiž domény podobné ubikvitinu (UBL) zodpovědné za vazbu na proteasom a domény asociované s ubikvitinem (UBA), zodpovědné za vazbu na ubikvitinované proteiny. Vedle toho však zřejmě mají v organismu i další funkce. Kvasinkový homolog Ddi1 je zapojen do řízení buněčného cyklu, hraje roli při degradaci HO endonukleasy a pravděpodobně také jako negativní regulátor exocytosy. Buněčné funkce nedávno identifikovaného lidského homologu Ddi2 zatím nejsou známy. Abychom přispěli k pochopení fysiologických funkcí lidského proteinu Ddi2, rozhodli jsme se identifikovat možné interakční partnery tohoto proteinu. Připravili jsme proto DNA konstrukty pro expresi proteinu Ddi2 v savčích buňkách HEK293 ve fúzi s afinitními značkami FLAG, HA a Myc, umožňujícími jejich snadnou visualizaci a purifikaci. Afinitní chromatografií spřaženou s hmotnostní spektrometrií (AP-MS) jsme identifikovali několik potenciálních proteinových partnerů Ddi2. Z nich byl jako nejzajímavější kandidát vybrán lidský protein Rad23B. Tento protein (z angl.. „radiation sensitive“) je důležitým faktorem při rozpoznávání poškozených úseků DNA a rovněž adaptorem pro přenos ubikvitinylovaných proteinů do proteasomu, podobně jako kvasinkový protein Ddi1. Pro ověření interakce identifikované hmotnostní spektrometrií jsme připravili rekombinantní protein Rad23B ve fúzi s afinitní značkou FLAG a v sérii experimentů jsme ověřili, že se specificky váže na rekombinantní protein Ddi2. Strukturní a funkční aspekty této interakce budou dále ověřovány.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Ddi1-like proteins (DNA damage-inducible) have been so far best characterized in yeast (Ddi1 protein from Saccharomyces cerevisiae), drosophila and quite recently also in human (Ddi2 protein). Based on their domain architecture they belong to the family of proteasomal shuttle proteins that transport ubiquitinated proteins for proteasomal degradation. They contain ubiquitin-associated domain (UBA) responsible for the interaction with proteasome subunits and ubiquitin-like domains (UBL) required for the interaction with ubiquitinated proteins. However, they also seem to have other functions. The yeast homolog Ddi1 is involved in cell cycle control, plays a role in the degradation of HO endonuclease and probably also functions as a negative regulator of exocytosis. The cellular functions of recently identified human homolog Ddi2 are not yet understood. In order to contribute to the understanding of the physiologic functions of human Ddi2 protein, we decided to identify potential binding partners of this protein. Therefore, we prepared DNA constructs for the expression of Ddi2 in mammalian HEK293 cells fused to two affinity tags, either FLAG or HA or Myc tag, that enable their facile visualisation and purification. Affinity chromatography coupled to mass spectrometry (AP-MS) aided in identifying several potential protein partners of Ddi2. Protein Rad23B has been selected as the most promising candidate. “Radiation sensitive” protein 23B is an important factor in the damage DNA recognition and also a proteasomal shuttle factor similar to yeast Ddi1. In order to confirm the interaction suggested by results from AP-MS, we prepared recombinant human protein Rad23B in fusion with the FLAG-tag and in a series of experiments confirmed its specific binding to human Ddi2. The structural and functional aspects of this interaction will be further analysed. (In Czech)
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Jan Belza 2.08 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Jan Belza 111 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Jan Belza 205 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Mgr. Klára Grantz Šašková, Ph.D. 572 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Ondřej Vaněk, Ph.D. 298 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D. 154 kB
Stáhnout Errata Bc. Jan Belza 259 kB