text size

Enzymatický systém anaerobních hub

Notice: I hereby declare that I am aware that the information acquired from theses published by Charles University may not be used for commercial purposes or may not be published for educational, scientific or other creative activities as activities of person other than the author.
Title:
Enzymatický systém anaerobních hub
Titile (in english):
Enzymatic system of anaerobic rumen fungi
Type:
Rigorosum thesis
Author:
RNDr. Zuzana Novotná, Ph.D.
Thesis Id:
141652
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Biochemistry (31-250)
Study programm:
Biochemistry (N1406)
Study branch:
Biochemistry (NBIOD)
Degree granted:
RNDr.
Defence date:
23/10/2013
Defence result:
Pass
Language:
Czech
Abstract (in czech):
Abstrakt Anaerobní houby, které osidlují zažívací trakt přežvýkavců a velkých býložravců, produkují řadu hydrolytických enzymů, včetně celulas, xylanas, mannas, esteras, glukosidas a glukanas, které účinně hydrolyzují rostlinnou biomasu. Ta se skládá především z celulosy a hemicelulosy, v biosféře nejvíce zastoupených polysacharidů. Mezi nejlépe prostudované anaerobní houby patří rody Neocallimastix a Piromyces, ostatní rody jsou studovány méně. Tato práce se proto soustředila na hydrolytický systém hub rodů Anaeromyces, Orpinomyces, Caecomyces a houby KF9, která je popsána jako nový druh houby patřící do rodu Piromyces. V této práci bylo potvrzeno, že anaerobní houby, pěstované v médiu M10 obohaceném bachorovou tekutinou a mikrokrystalickou celulosou jako zdrojem uhlíku, produkují celou řadu enzymů potřebných pro rozklad rostlinných strukturálních a zásobních sacharidů, jako celulasu, endoglukanasu, xylanasu, α-xylosidasu, β-xylosidasu, α-glukosidasu, β-glukosidasu, β-galaktosidasu, mannosidasu, cellobiohydrolasu, amylasu, laminarinasu, pektinasu a pektat- lyasu. Tyto enzymy byly produkovány jak v intra- tak v extracelulární frakci, ale převážně byly uvolňovány do extracelulární frakce s vyjímkou β-xylosidasy, chitinasy, N-acetylglukosaminidasy a lipasy. Aktivita xylanas byla dominantní mezi ostatními hydrolasami, proto byl xylanolytický systém studován detailněji. Aktivita endoxylanasy a xylosidasy u anaerobních bachorových hub rodu Anaeromyces, Orpinomyces, Caecomyces a nové houby KF9 dosahovala nejvyšších hodnot 4.-7. den kultivace a oba enzymy byly produkovány na všech studovaných zdrojích uhlíku (glukosa, cellobiosa, fosfo-celulosa, mc-celulosa, xylosa, hemicelulosa, celulosa, cm-celulosa, cm- xylan, škrob, laktosa, arabinosa a xylan). Aktivita endoxylanasy a β-xylosidasy byla sledována v 6 různých buněčných frakcích (frakce z buněčných stěn, hydrogenosomální frakce, lysozomová frakce, mikrosomální frakce a cytosolová frakce) včetně média (extracelulární frakce). Obecně platí, že endoxylanasa je vylučována do kultivačního média, zatímco β-xylosidasa je spojena s buněčnou stěnou a cytosolovou frakcí. Endoxylanasy studovaných bachorových hub vykazovaly několik isoforem s molekulovými hmotnostmi v rozmezí 22 až 146 kDa. Xylosidasy tvoří 2 isoformy s molekulovou hmotností 39 a 89 kDa. Endoxylanasa a xylosidasa anaerobní bachorové houby KF8 rodu Anaeromyces byla čištěna pomocí Sephadexu G-100. Zatímco u xylosidasy bylo zjištěno, že vytváří jen jeden výrazný pík, endoxylanasa produkovala několik podobných píků. Xylanasa anaerobních hub kmenů Anaeromyces a Orpinomyces byla podrobena fylogenetické analyse. Z výsledků RaxML-HPC (Randomized Axcelerated Maximum Likelihood) fylogenetické analysy vyplývá, že sekvence xylanas hub rodu Anaeromyces a Orpinomyces tvoří jednu skupinu s GenBank sekvencemi xylanas hub rodu Neocallimastix a Piromyces sp. a vytvářejí monofyletickou skupinu xylanas anaerobních hub. Uvnitř této monofyletické skupiny však sekvence xylanas jak rodu Orpinomyces, tak rodu Anaeromyces vytvářejí samostatné větve, i když spadají do stejného klastru jako xylanasy rodu Neocallimastix a Piromyces. Xylanasy anaerobních hub jsou překvapivě více podobné bakteriálním xylanasám (klastr klostridií a bakterie Bacillus) nežli xylanasám plísní (klastr Dikaryi), což ukazuje na možný horizontální přenos genů mezi bakteriemi a anerobními houbami v bachoru. Dále byl studován chitinolytický systém anaerobních polycentrických bachorových hub rodu Orpinomyces a Anaeromyces. Aktivity čtyř chitin degradujících enzymů - endochitinasy, exochitinasy, N-acetyglukosaminidasy a deacetylasy- byly zkoumány ve třech frakcích: extracelulární, cytosolová a frakce z buněčné stěn. Endochitinasa se projevila jako dominantní enzym s největší aktivitou v cytosolové frakci. Endochitinasy u obou rodů jsou stabilní v rozmezí pH 4,5 - 7 s optimálním pH 6,5. Endochitinasa rodu Orpinomyces byla stabilní až do 50°C s optimální teplotou 50°C, zatímco endochitinasa rodu Anaeromyces byla stabilní do 40°C s optimální teplotou 40°C. Nejvhodnějším substrátem pro endochitinasu byl shledán chitin připravený z buněčných stěn hub, což je logický výsledek. Enzymatická aktivita endochitinasy byla inhibována ionty Hg2+ a aktivována ionty Mg2+. Obě endochitinasy byly inhibovány 10mM SDS a aktivovány iodacetamidem. Poslední část této práce je věnována popisu nové houby KF9. Tato monocentrická houba byla izolována z kravské bachorové tekutiny. Kmen KF9 produkoval sporangia velmi různých tvarů: kulové (průměr 25 až 70 μm), rozdvojené nebo podlouhlé (velikost 20-25 x 50-100 μm). Některá sporangia jsou oddělena od sporangiophoru basalním septem. Jádra v myceliu byla lokalizována ve sporangiích a sporangiophorech. Celé mycelium kromě sporangia se skládá z úzkých rozvětvených hyf s mnoha oddenky. Jednojaderné polyflagelární (3-12 bičíků dlouhých 30-40 μm orientovaných vzadu) zoospory jsou elipsoidní až kulovité (v průměru 7-12 μm). Mezi hlavní konečné produkty kmene KF9 patří acetát. Sekvenční analýza ITS1 fragmentu rDNA ukázala, že tento kmen patří k rodu Piromyces, avšak představuje nový typ. Pravděpodobně nový druh, který musí být popsán.
Abstract:
Abstract Anaerobic fungi inhabiting the digestive tract of large herbivores secrete a variety of hydrolytic enzymes, including cellulases, xylanases, mannases, esterases, glucosidases, and glucanases, which effectively hydrolyze plant biomass consisting mainly of cellulose and hemicellulose, the most abundant polysaccharides in the biosphere. The immense progress has been achieved in investigation of Neocallimastix, Piromyces, however other genera are less studied. This work therefore concentrated the effort to analyze the hydrolytic system of genera Anaeromyces, Orpinomyces, Caecomyces and fungus KF9 described as new type of fungus belonging to the genus Piromyces. The studied anaerobic fungi grown in batch culture on M10 medium with rumen fluid and microcrystalline cellulose as carbon source produced a broad range of enzymes requisite for degradation of plant structural and storage carbohydrates including cellulase, endoglucanase, xylanase, α-xylosidase, β-xylosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, β-galactosidase, mannosidase, cellobiohydrolase, amylase, laminarinase, pectinase and pectate lyase. These enzymes were detected in both the intra- and extra-cellular fractions, but production into the medium was prevalent with exception for intracellular β-xylosidase, chitinases, N-acetylglucosaminidase, and lipase. Xylanase activity was predominant among the polysaccharide hydrolases. Xylanolytic enzymes were therefore studied in detail. Activity of endoxylanase and xylosidase of studied rumen fungi Anaeromyces, Orpinomyces, Caecomyces and new fungus KF9 were the highest in 4-7 days after inoculation and were produced on all studied carbon sources (glucose, cellobiose, phospho-cellulose, mc-cellulose, xylose, hemicellulose, cellulose, cm-cellulose, cm-xylan, starch, lactose, arabinose and xylan). Activities of endoxylanase and β-xylosidase were detected in 6 different cell fractions including medium (extracellular), cell wall, hydrogenosome, lysozome, microsomal and cytosolic fraction. In general, endoxylanase was secreted into the culture medium while β-xylosidase was associated with fungal cells and cytosolic fraction. Endoxylanases of studied rumen fungi exhibited several isoformes of xylanases with approximate molecular weights ranging from 22 to 146 kDa. Xylosidases exhibited 2 isoforms with molecular weight 39 and 89 kDa. Endoxylanase and xylosidase of rumen fungus KF8 of genera Anaeromyces was purified using SEPHADEX G-100. While xylosidase was found to produce only one expressive peak, the endoxylanase produced several similar peaks. Xylanases of strains of Anaeromyces and Orpinomyces have been subjected to phylogenetic analysis. Randomized Axcelerated Maximum Likelihood phylogenetic analysis resulted in tree, where xylanase sequences of Anaeromyces and Orpinomyces grouped well together with GenBank sequences derived from Neocallimastix and Piromyces sp. creating monophyletic group of xylanases of anaerobic fungi. On the other hand, inside this group, Orpinomyces and Anaeromyces xylanase sequences grouped separately and both formed sister clade of mixed Neocallimastix and Piromyces xylanase clade. Surprisingly xylanases of anaerobic fungi are more similar to bacterial xylanases (clade of clostridia and bacilly) then fungal xylanases (clade of dikarya), which indicates the possible horizontal gene transfer between rumen bacteria and rumen anaerobic fungi. The increase attention was further paid to chitinolytic system of anaerobic polycentric rumen fungi of genera Orpinomyces and Anaeromyces. Activities of four chitin splitting enzymes including endochitinase, exochitinase, N-acetyglucosaminidase and deacetylase were studied in three crude enzyme fractions- extracellular, cytosolic and cell wall fraction. Endochitinase was found as a dominant enzyme with highest activity in cytosolic fraction. Endochitinases of both genera were stable from pH 4.5 to 7 with optimal pH 6.5. 0C 0C, Orpinomyces endochitinase was stable up to 50 with optimal temperature 50 while 0C 0C. Anaeromyces endochitinase was stable up to 40 with optimal temperature also 40 The most suitable substrate for both endochitinases was fungal cell wall chitin. Enzyme activities were inhibited by Hg2+ ions and activated by Mg2+ ions. Both endochitinases were inhibited by 10 mM SDS and activated by iodacetamide. The last part of this work is devoted to description of new fungus KF9. This fungus with monocentric thallus was isolated from cattle rumen fluid. Strain KF9 was willing to produce sporangia of very different shapes: globular (average 25 až 70 μm), bifurcated or elongated (size 20-25 x 50-100 μm). On some sporanga the separation from the flexuous sporangiophore by septum was visible. The nuclei of thalli were indicated in sporangia and sporangiophores. The whole mycelium except sporangia is composed of branched narrow hyphae with many stolons. Uninucleate and polyflagellate (3-12 flagella, 30-40 μm, posteriorly orientated) zoospores is elipsoidal or globular (average 7-12 μm). The main end products of the strain KF9 was found to be acetate. Sequence analysis of ITS1 fragment of rDNA indicated that this strain belong to genus Piromyces, however represents a new type. Probably new species, which has to be described.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis RNDr. Zuzana Novotná, Ph.D. 3.38 MB
Download Abstract in czech RNDr. Zuzana Novotná, Ph.D. 78 kB
Download Abstract in english RNDr. Zuzana Novotná, Ph.D. 76 kB
Download Defence's report prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc. 152 kB