velikost textu

Validace metody High Resolution Melting (HRM) pro účely DNAdiagnostiky; mutační analýza genu cystické fibrózy a vybraných kandidátních genů u mužské infertility

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Validace metody High Resolution Melting (HRM) pro účely DNAdiagnostiky; mutační analýza genu cystické fibrózy a vybraných kandidátních genů u mužské infertility
Název v angličtině:
Validation of High Resolution Melting (HRM) for the purpose of DNA diagnostics: mutation analysis of the cystic fibrosis gene and selected candidates genes of male intertility
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
RNDr. Petra Peldová, Ph.D.
Id práce:
139837
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Genetika, molekulární biologie a virologie (NGEMOVI)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
17. 10. 2013
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT V posledních letech došlo k výraznému rozvoji molekulárně genetické diagnostiky (DNA diagnostiky). Jsou zaváděny nové metody a technologie a rozšiřováno spektrum genetických služeb. Jelikož výsledky genetických testů zárodečného genomu mohou celoživotně ovlivnit zdraví a kvalitu života pacienta i jeho rodiny, je kladen důraz na neustálé zvyšování kvality poskytovaných diagnostických služeb. Stále více laboratoří přechází z „domácích metod“ na komerční diagnostické soupravy, ale často pak svévolně modifikují protokoly výrobce. Proto je pro zajištění kvality genetických testů nezbytné všechny metody a technologie před zavedením do rutinní diagnostické praxe řádně validovat a verifikovat. V této dizertační práci jsem se věnovala otázce vhodnosti a využitelnosti metody High Resolution Melting (HRM) v diagnostice na základě její kompletní validace dle mezinárodních požadavků normy na řízení systému jakosti (ISO 15189). Potvrdili jsme užitečnost této metody a její výhody pro mutační skenování neznámých variant i genotypizaci častých polymorfismů, a to na příkladu různých genů (BRCA1, MTHFR či CFTR). Zároveň jsme poskytli metodické pokyny a postupy pro usnadnění diagnostické implementace této technologie a umožnění jejího úspěšného využití i v dalších genetických laboratořích, a na příkladu validace HRM poskytli návody a model pro validaci dalších DNA diagnostických metod. O zvýšení kvality poskytovaných genetických služeb jsme se zasadili i v oblasti diagnostiky cystické fibrózy (CF). Toto frekventované monogenní onemocnění je charakterizováno velkým množstvím identifikovaných mutací v genu CFTR a molekulární heterogenitou v závislosti na etnicitě probanda, proto je znalost distribuce a četnosti mutací tohoto genu v každé populaci klíčová. Molekulárně genetickými studiemi jsme zmapovali spektrum mutací u českých a ukrajinských pacientů s CF, neboť identifikace obou kauzálních mutací podpoří klinickou diagnózu, umožní předpovědět průběh onemocnění, individuálně stanovit léčbu, poskytnout spolehlivou prenatální diagnostiku a stanovit přenos těchto alel a rizik u dalších rodinných příslušníků. Vysoká populační záchytnost umožní zavedení novorozeneckého skríningu, který vyhledá postižené pacienty v preklinickém stádiu. Včasné stanovení diagnózy a brzká aplikace léčby příznivě ovlivní průběh choroby a zároveň sníží náklady na léčbu. V současné době je věnována velká pozornost problematice neplodnosti, neboť postihuje až 15% párů a dochází k jejímu nárůstu. Muž se na neplodnosti páru podílí v přibližně 50% případů. Po vyloučení rutinně vyšetřovaných příčin mužské neplodnosti (např. mutace v genu cystické fibrózy, Klinefelterův syndrom, strukturální abnormality Y chromozomu, prodělané záněty varlat virem příušnic, tumor atd.) nadále zůstává mnoho případů neobjasněno. Proto jsem se v rámci tohoto studia zabývala analýzou protaminových genů (PRM1, PRM2), neboť plní stěžejní funkci při diferenciaci spermií a bylo prokázáno, že myši haploinsuficientní pro jeden z protaminových genů vykazují poruchu uspořádání chromatinu, jaderné integrity a produkují spermie abnormální morfologie a snížené pohyblivosti, které nejsou schopné oplodnit oocyt. Na reprezentativním souboru německých teratozoospermických mužů s normálním počtem spermií (simulující fenotyp PRM-haploinsuficientní myši) a mužů se sníženým počtem spermií, včetně souboru normozoospermických mužů jako kontrol, byla provedena mutační analýza protaminových genů zkoumající vliv případných mutací na poruchu spermiogeneze. Podařilo se nalézt statisticky signifikantní asociaci mezi haplotypem ACC, tvořeným třemi častými polymorfismy genů PRM1/2, a koncentrací spermií a jejich celkovým počtem. Homozygotní nosiči haplotypu ACC měli dvojnásobně vyšší počet spermií než muži bez tohoto haplotypu (45x106/ml x 24.2x106/ml). Je možné, že spermie nosičů jiného než ACC haplotypu nejsou životaschopné či podléhají negativní selekci. Pro určení klinického významu tohoto zjištění a jeho případného diagnostického využití je však potřeba nález ověřit studiemi na dalších souborech a populacích.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT During the last years we have observed a rapid development of molecular genetic diagnostics (DNA diagnostics). New methods and technologies are rapidly being introduced and the spectrum of genetic services is gradually extended. Since germline genetic tests might have lifelong influence health and quality of patient's life, all efforts should aim at improvement of the overall quality of provided diagnostic services. An increasing number of laboratories replace their “in- house” developed techniques by the commercial diagnostic assays, but they often modify manufacturer's instructions. Therefore, it is necessary to validate and verify all methods and techniques before their implementation into routine DNA diagnostics. In this thesis I have focused on evaluation and application of High Resolution Melting (HRM) in clinical diagnostic practice based on its comprehensive validation, according to the major international quality assurance standard ISO 15189. On the model of selected genes (BRCA1, MTHFR, CFTR) we have confirmed the high utility of HRM for mutation scanning of unknown variants, as well as genotyping of common variants. Concurrently, we have provided a list of methodical guidelines which could be applied for setting up HRM in other genetic laboratories and provided a diagnostic validation strategy for other DNA diagnostic techniques. Furthermore, we have contributed to the higher quality of genetic services in the area of diagnostics of cystic fibrosis. This common life-threatening autosomal recessive disease is known for a substantial number of mutations in the CFTR gene and for its molecular heterogeneity based on the patient's ethnicity. Therefore, it is important to analyse mutation distribution and frequency of CFTR gene mutations among different populations. In this thesis, I have presented a comprehensive overview of CFTR mutations at Czech and Ukrainian CF patients, since identification of both causal mutations will support a clinical diagnosis, allow clinical prognosis, individually assess appropriate medical treatment, provide a reliable prenatal diagnostics and determine the risk for other family members. The high population detection rate will enable implementation of CF newborn screening, which helps to find CF patients before symptom occurrence. Such an early establishment of CF diagnosis and an immediate application of medical treatment favourably influence the overall clinical outcome and reduce the costs for treatment in this disease. Human infertility is a serious medical and socio-economic issue since it currently affects approximately 15% of couples and this number is still increasing. The “male factor” in reproductive failure accounts for 50% of all cases, while many causes still remain unknown. Therefore, we performed a mutation analysis of protamine genes (PRM1 and PRM2), as they play a crucial role in differentiation of spermatids. It was demonstrated that knockout (KO) of either protamine gene in mice results in male infertility due to an alteration in sperm chromatin assembly and nuclear integrity. These Prm1 or Prm2 haploinsufficient mice produce sperm exhibiting abnormal morphology, combined with reduced motility and are thus unable to fertilize an oocyte. We sequenced both genes in representative groups of German idiopathic infertile patients with distinct teratozoospermia and normal (resembling the phenotype of the KO mice) or reduced sperm concentration and in normozoospermic men as a control, in order to investigate the impact of protamine gene sequence variations on spermatogenesis. We have revealed a statistical significant association of ACC haplotype, formed by the three common SNPs of PRM1/2 genes, and sperm concentration/count. Homozygous carriers of ACC haplotype had a twofold higher sperm concentration and count than men lacking this haplotype (45x106/mL x 24.2x106/mL). Spermatozoa without the ACC haplotype might not be viable or might be subjected to negative selection. For the clinical impact of this finding and its implementation to the diagnostics it is necessary to confirm results by other studies on different cohorts and/or populations.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Petra Peldová, Ph.D. 1.82 MB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Petra Peldová, Ph.D. 4.26 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Petra Peldová, Ph.D. 23 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Petra Peldová, Ph.D. 11 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 550 kB