text size

Možnosti průtokové cytometrie v analýze reakce buněk na genotoxický stres

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Možnosti průtokové cytometrie v analýze reakce buněk na genotoxický stres
Titile (in english):
Possibilities of flow cytometry in analysis of cellular response to genotoxic stress
Type:
Rigorosum thesis
Author:
RNDr. Radim Havelek, Ph.D.
Supervisor:
prof. MUDr. Martina Řezáčová, Ph.D.
Opponents:
doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.
prof. RNDr. Rudolf Štětina, CSc.
Thesis Id:
138261
Faculty:
Faculty of Pharmacy in Hradec Králové (FaF)
Department:
Department of Biochemical Sciences (16-16160)
Study programm:
Zdravotnická bioanalytika (N5207)
Study branch:
Healthcare bioanalytics (ZB)
Degree granted:
RNDr.
Defence date:
12/03/2013
Defence result:
Pass
Language:
Czech
Abstract (in czech):
Abstrakt Možnosti průtokové cytometrie v analýze reakce buněk na genotoxický stres Průtoková cytometrie je moderní metoda analýzy imunofenotypu a funkčních charakteristik buněk. Je to technika kvantitativní analýzy jedné buňky, která k detekci využívá optických vlastností buněk unášených v proudu nosné kapaliny stanovených paprskem laseru. Analýza a rozlišení buněk je založena na jejich velikosti, granularitě, a zdali buňka nese fluorescenční molekulu ve formě konjugované protilátky, nebo fluorescenčního barviva. Buňky mohou být značeny fluorescenčními barvivy, inkubovány s fluorogeními substráty, označeny fluorochromy konjugovanými protilátkami specifickými k molekulám na povrchu nebo uvnitř buňky. Průtokové cytometry jsou multiparametrické, zaznamenávající několik měření z jedné buňky. Z tohoto důvodu jsme schopni identifikovat homogenní subpopulaci v heterogenní populaci buněk. Buňky vystaveny působení genotoxických agens reagují kvantitativně a kvalitativně v závislosti na absorbované dávce a buněčném typu. S cílem vypořádat se s poškozením buněčné DNA dojde k aktivaci dočasné zástavy buněčné cyklu a mechanismů odpovědi na poškození DNA, jež poskytnou nezbytný čas k její účinné opravě. Za situace kdy tyto mechanismy selžou, nebo poškození DNA je neopravitelné, dojde k buněčné smrti apoptózou, nebo je indukovaná stresem indukovaná předčasná senescence. Ze všech typů poškození DNA představují dvouvláknové zlomy DNA (DSB) nejvíce nebezpečnou formu. V molekulární odpovědi na vznik DSB dojde k rychlé fosforylaci serinu 139 v C-terminální oblasti molekuly H2AX aktivitou proteinkinas z rodiny fosfatidylinositol-3 kinas (PI3K) zahrnující ataxia telangiectasia mutated (ATM), ATR (ATM a Rad3-related protein) a DNA- dependentní protein kinasu (DNA-PK). Histon H2AX fosforylovaný na serinu 139 je označován jako γH2AX, jeho tvorba dosahuje maxima přibližně 1 hodinu od vzniku DSB a je jedním z nejčasnějších dějů v odpovědi na poškození DNA. Cílem naší práce bylo kvantifikovat DSB in vivo a in vitro, změny buněčného cyklu, apoptózu a senescenci indukovanou genotoxickými agens použitím vybraných metod průtokové cytometrie. Jako genotoxická agens jsme použili ionizující záření, cisplatinu, mitoxantron a vanadocen dichlorid. Studie byla prováděná s použitím rozdílných prototypů buněk: potkaní a lidské lymfocyty, mesenchymální kmenové buňky, leukemické buněčné linie HL-60 a MOLT-4. Imunofluorescenční analýza γH2AX přestavuje spolehlivou a citlivou metodu pro kvantitativní stanovení DSB DNA. Naše výsledky ukazují, že kvantifikace vzniku γH2AX v potkaních lymfocytech periferní krve 1 hodinu od ozáření tvoří časný screeningový biodozimetrický nástroj pro stanovení obdržené dávky celotělového nebo hrudního ozáření. Tato metoda může pomoci lékařům k odhadu organismem obdržené dávky záření a na základě výsledků tak poskytnout ozářeným osobám odpovídající typ lékařské intervence s cílem zlepšit výsledek léčby každého jednotlivce. Vzestup tvorby γH2AX v potkaních lymfocytech periferní krve byl 24 hodin od celotělového a hrudního ozáření potkanů doprovázen dávkově závislou leukopenií a lymfopenií. Mesenchymální kmenové buňky reagují na ionizující záření stresem indukovanou senescencí bez indukce apoptózy, a to ani po vysokých dávkách gama záření. V krátkém čase po ozáření se v mezenchymálních kmenových buňkách tvoří ohniska γH2AX indukovaná DSB. Většina DSB je reparovaná během 24 hodin, kdy zároveň vymizí nejvíce ohnisek γH2AX. Bylo zjištěno, že fosforylace H2AX je závislá na ATM kinase. Inhibice ATM pomocí KU55933 zcela potlačila vznik ohnisek γH2AX. Analýzou buněčného cyklu jsme zjistili, že v odpovědi na gama ozáření došlo k akumulaci buněk v G2 fázi buněčného cyklu. Pozorovali jsme vzestup β-galaktosidasy spojené se senescencí za použití fluorogenního substrátu a cytochemie. Naše výsledky ukázaly cytotoxický efekt vanadocen dichloridu na leukemické buňky a bohužel také na lidské lymfocyty periferní krve. Vanadocen dichlorid indukuje apoptózu u leukemických buněk, avšak indukce apoptózy je nižší než po působení cisplatiny. Pozorovali jsme lineární dávkově závislý vztah mezi dávkou vanadocen dichloridu a fosforylací H2AX v leukemických buňkách HL-60 1 hodinu od přidání vanadocen dichloridu. Data naznačují, že cytotoxický efekt vanadocen dichloridu na leukemické buňky může být částečně zprostředkován tvorbou DSB.
Abstract:
Abstract Possibilities of flow cytometry in analysis of cellular response to genotoxic stress Flow cytometry is a modern tool for interrogating the immunophenotype and functional characteristics of cells. It is a technique of quantitative single cell analysis that works by sensing optical properties of cells in a flow stream with laser beam. Analysis and differentiation of the cells is based on size, granularity, and whether the cell is carrying fluorescent molecules in the form of either conjugated antibodies or dyes. The cells may be stained with fluorescent dyes, incubated with fluorogenic substrate or labelled with fluorochrome-linked antibodies specific for molecules either on the surface or in the intracellular components of the cell. Flow cytometers are multiparameter, recording several measurements on each cell. Therefore, it is possible to identify a homogeneous subpopulation within a heterogeneous population of cells. When cells are exposed to genotoxic agent, they respond quantitatively and qualitatively according to the absorbed dose and the cell type. To cope with the resulting damage to cellular DNA, the temporary cell-cycle checkpoints and DNA damage response mechanisms are activated to allow more time for effective repair. However, if these mechanisms fail or the damage is irreparable, then cell death via apoptosis or stress-induced premature senescence is induced. Among the different types of DNA damage, DNA double strand breaks (DSB) are the most detrimental type of DNA lesions. In molecular cell response to DSB, the conserved C-terminal tail of histone H2AX becomes rapidly phosphorylated at serine 139 by phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-like kinases family, including ataxia telangiectasia mutated (ATM), ATR (ATM and Rad3-related protein), and DNA-dependent protein kinase (DNA-PK). The serine 139 phosphorylated histone H2AX is denoted as γH2AX, its creation peak approximately 1 hour after DSB formation and is one of the earliest known event involved in DNA damage response pathway. The aim of our work was to quantify DSB in vivo and in vitro, cell cycle changes, apoptosis and senescence induced by genotoxic agents using selected flow cytometry methods. We used ionizing radiation, cisplatin, mitoxantrone and vanadocene dichloride as genotoxic agents. Experiments were performed using diverse prototype of cells: rat or human lymphocytes, mesenchymal stem cells, leukemia cell lines HL-60 and MOLT-4. The immunofluorescence-based detection of γH2AX is a reliable and sensitive method for quantitatively measuring DNA DSB. Our findings indicate that quantification of γH2AX formation in rat peripheral blood lymphocytes 1 hour from irradiation make an early screening biological dosimeter for analyzing received dose of whole-body or thoracic radiation. This tool might help clinicians estimate received dose of radiation by organism and in consequence based on the results provide appropriate types of medical intervention to irradiated persons for optimal individual outcome. An increase in formation of γH2AX in rat peripheral blood lymphocytes was accompanied by dose dependent leukopenia and lymphopenia 24 hours following whole-body and thoracic irradiation of rat. Mesenchymal stem cells respond to ionizing radiation by stress-induced premature senescence without induction of apotosis, even after high doses of gamma radiation. Quickly following irradiation DSB-induced γH2AX foci are formed in mesenchymal stem cells. Majority of DSB lesions are repaired within 24 h when most γH2AX foci have disappeared. The phosphorylation of H2AX was found to be ATM dependent. The inhibition of ATM by KU55933 completely abrogates the formation of γH2AX foci. Using cell cycle analysis we found that mesenchymal stem cells are preferentially accumulated in the G2 phase of the cell cycle in response to gamma irradiation. We observed increase in senescence-associated β-galactosidase activity using fluorogenic substrate and cytochemistry. Our findings showed cytotoxic effect of vanadocene dichloride on leukemia cells, but unfortunately on human peripheral blood lymphocytes as well. Vanadocene dichloride induces apoptosis in leukemia cells; the induction is, however, lower than that of cisplatin. A linear dose- response relationship between vanadocene dichloride dose and phosphorylation of H2AX in leukemia cells 1 hour after vanadocene dichloride treatment was observed. The data indicate that cytotoxic effect of vanadocene dichloride on leukemia cells can be particularly mediated by the formation of DSB.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis RNDr. Radim Havelek, Ph.D. 12.79 MB
Download Abstract in czech RNDr. Radim Havelek, Ph.D. 36 kB
Download Abstract in english RNDr. Radim Havelek, Ph.D. 25 kB
Download Opponent's review doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. 63 kB
Download Opponent's review prof. RNDr. Rudolf Štětina, CSc. 42 kB
Download Defence's report Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. 75 kB