velikost textu

New redox labels for DNA

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
New redox labels for DNA
Název v češtině:
Nové redoxní značky pro DNA
Typ:
Disertační práce
Autor:
Anna Simonova, Ph.D.
Školitel:
prof. doc. Ing. Michal Hocek, DSc.
Oponenti:
RNDr. Milan Urban
RNDr. Vlastimil Vyskočil, Ph.D.
Id práce:
134351
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra organické chemie (31-270)
Program studia:
Organická chemie (P1402)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
17. 12. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
značení DNA, elektrochemie, nukleotidy
Klíčová slova v angličtině:
DNA labelling, electrochemistry, nucleotides
Abstrakt:
Abstrakt Cílem mé disertace byla syntéza modifikovaných 2’-deoxyribonukleosid trifosfátů (dNTP) nesoucích elektrochemicky oxidovatelné značky a jejich inkorporace do DNA pro aplikace v bioanalýze. V první části disertace jsem vyvinula syntézu modifikovaných dNTP nesoucích 2,3- dihydrobenzofuran (DHB) nebo 2-methoxyphenol (MOP) v poloze 5 u 2'-deoxycytidin-5'-O- trifosfátu a v poloze 7 u 7-deaza-2'-deoxyadenosin-5'-O-trifosfátu pomocí Suzukiho- Miyaurových cross-coupling reakcí. Poté byly modifikované dNTP využity jako substráty pro DNA polymerasy při enzymové syntéze modifikovaných DNA pomocí PCR nebo prodlužování primeru. Studovali jsme elektrochemické vlastnosti nukleosidů, dNTP a DNA značených DHB nebo MOP skupinami s použitím metod square-wave voltametrie (SWV) na pyrolytické grafitové elektrodě (PGE) a pozorovali signály oxidace MOP při cca. 0.5 V a oxidaci DHB při 0.85V. Využití DHB skupiny v kombinaci s dalšími redoxními značkami bylo limitováno blízkostí pozice jejího oxidačního píku k signálům přirozených nukleobází, zatímco MOP skupina byla úspěšně použita k redoxnímu kódování nukleobází v kombinaci s aminofenylovou nebo benzofurazanovou značkou, kdy každá značka poskytla odlišný a nezávisle detekovatelný redoxní signál. V druhé části disertace jsem studovala fenothiazin (PT) jako novou redoxní značku. Syntéza nukleosidů a dNTP modifikovaných PT byla prováděna pomocí Suzukiho-Miyaurových nebo Sonogashirových cross-coupling reakcí. Modifikované DNA nesoucí PT značky byly syntetizovány pomocí enzymových reakcí: prodlužování primeru, PCR nebo nicking enzyme amplifikační reakce. Modifikovaná nukleosidy a dNTPs nesoucí PT skupinu vázanou přes acetylenový můstek vykazovaly fluorescenční vlastnosti. Elektrochemické vlastnosti nukleosidů, dNTPs a DNA modifikovaných PT byly studovány cyklickou voltametrií (CV) a SWV na pyrolytické grafitové elektrodě a vykazovaly anodické signály v oblasti 0.66 V a 0.86 V. PT skupina byla rovněž studována pro multipotenciálové kódování DNA bázi v kombinaci s benzofuranovou nebo nitrofenylovou skupinou. V poslední části byly studovány ferrocenové (Fc) deriváty s elektron-donorními a elektron- akceptorními skupinami jako nové redoxní značky s laditelným redoxním potenciálem. Navrhla a syntetizovala jsem 1-(N,N-dimethylaminocarbonyl)-1'-ethynylferrocen a 1-fluoro- 1'-ethynylferrocen jako stavební bloky pro syntézu modifikovaných nukleosidů a nukleotidů. Tyto nové deriváty, a také známé 1-ethynyl-1',2,2',3,3',4,4',5-octamethylferrocen a propargylamidoferrocen, byly použity pro Sonogashirovy cross-coupling reakce s halogenovanými dNTPs. Získané značené nukleotidy nesoucí modifikované Fc skupiny byly použity jako substráty pro enzymovou syntézu modifikované DNA. Dosud byly prostudovány elektrochemické vlastnosti modifikovaných nukleosidů pomocí SWV, zatímco další elektrochemické studie a aplikace dNTP a DNA značených modifikovanými Fc skupinami bude studována v blízké budoucnosti ve spolupráci s týmem Doc. Fojty.
Abstract v angličtině:
Abstract The aim of my thesis was the synthesis of the modified 2’-deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) bearing electrochemically oxidizable labels and their incorporation into DNA for the application in bioanalysis. In the first part of my thesis, I developed the synthesis of modified dNTPs bearing 2,3- dihydrobenzofuran (DHB) or 2-methoxyphenol (MOP) labels at 5-position of 2'- deoxycytidine 5'-O-triphosphate and at the 7-position of 7-deaza-2'-deoxyadenosine 5'-O- triphosphate by Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions. Then modified dNTPs were used as substrates for DNA polymerases in enzymatic synthesis of modified DNA by PCR and primer extension. Electrochemical properties of the DHB and MOP-labeled nucleosides, dNTPs and DNA were studied by using of a square-wave voltammetry (SWV) at the pyrolytic graphite electrode (PGE) giving signals of MOP oxidation around 0.5 V and DHB oxidation around 0.85 V. The use of DHB group in combination with other electrochemical active labels was limited by close position of its oxidation peak to the signals of oxidation of natural nucleobases, whereas MOP moiety was successfully used for redox coding of nucleobases in combination with aminophenyl or benzofurazane label giving two independently readable redox signals in each case. In the second part of this thesis, phenothiazine (PT) was tested as a new redox label. Synthesis of PT-modified nucleosides and dNTPs were performed by Suzuki-Miyaura and Sonogashira cross-coupling reactions. Modified DNA bearing PT labels were enzymatically synthesized by primer extension, PCR and nicking enzyme amplification reactions. Modified nucleosides and dNTPs containing PT-group through the acetylene linker also displayed fluorescence properties. Electrochemical properties of the PT-modified nucleosides, nucleotides and DNA were studied by cyclic (CV) and square-wave voltammetry at the pyrolytic graphite electrode showing anodic peaks in the region 0.66 V and 0.86 V. PT moiety was also studied as a label for multipotential coding of DNA bases in combination with benzofurazane or nitrophenyl moiety. Finally, new substituted ferrocene (Fc) derivatives with electron donating and electron withdrawing groups were studied as new redox labels with tunable redox potential. I designed and prepared 1-(N,N-dimethylaminocarbonyl)-1'-ethynylferrocene and 1-fluoro-1'- ethynylferrocene as building blocks for the synthesis of modified nucleosides and nucleoside triphosphates. These new derivatives, as well as known 1-ethynyl-1',2,2',3,3',4,4',5- octamethylferrocene and propargylamidoferrocene, were used for Sonogashira cross-coupling reactions with halogenated dNTPs. The obtained nucleotides bearing modified Fc labels were used as substrates for enzymatic synthesis of modified DNA. So far, electrochemical properties of modified nucleosides were studied by SWV, whereas further electrochemical studies and applications of Fc-modified dNTPs and DNA will be examined in near future in collaboration with the Fojta group.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Anna Simonova, Ph.D. 11.83 MB
Stáhnout Příloha k práci Anna Simonova, Ph.D. 302 kB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Anna Simonova, Ph.D. 52 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Anna Simonova, Ph.D. 33 kB
Stáhnout Posudek vedoucího prof. doc. Ing. Michal Hocek, DSc. 275 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Milan Urban 323 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Vlastimil Vyskočil, Ph.D. 227 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 356 kB