velikost textu

Potenciální využití WIP1 fosfatasy v terapii nádorového onemocnění prsu

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Potenciální využití WIP1 fosfatasy v terapii nádorového onemocnění prsu
Název v angličtině:
WIP1 phosphatase as a potential pharmacological target in breast cancer
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Soňa Pecháčková
Školitel:
MUDr. Libor Macůrek, Ph.D.
Oponenti:
RNDr. Pavel Souček, CSc.
doc. Mgr. Lumír Krejčí, Ph.D.
Id práce:
130266
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová a buněčná biologie (P1529)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
17. 5. 2017
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
fosfatáza, poškození DNA, structure
Klíčová slova v angličtině:
phosphatase, DNA damage, structure
Abstrakt:
Abstract (Czech) Buňky našeho těla reagují na genotoxický stres aktivací signální dráhy, která se nazývá buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response; DDR). V závislosti na typu poškození DNA, DDR dráha vede k dočasnému zastavení buněčného cyklu v kontrolních bodech (tzv. checkpointech), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo k programované buněčné smrti (apoptóza). Aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu brání progresi buněk a usnadňuje opravu poškozené DNA. DDR představuje bariéru před nárůstem genomové nestability a chrání buňky před vznikem rakoviny. WIP1 (kódovaná genem PPM1D) fosfatasa je hlavním negativním regulátorem DDR dráhy a je nezbytná pro ukončení kontrolních bodů buněčného cyklu. Tato práce přispěla k pochopení molekulárních mechanismů funkce WIP1 fosfatasy a popisuje, jak může být WIP1 fosfatasa zapojena při vzniku nádorů. Nejprve jsme popsali, že hladina WIP1 klesá během mitózy pomocí APC-Cdc20 komplexu, který způsobuje proteasomální degradaci proteinu. WIP1 je v průběhu mitózy fosforylovaná na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice WIP1 v mitóze umožňuje reagovat na nízkou hladinu DNA poškození, ke které dochází v průběhu nenarušené mitózy. Dále jsme identifikovali nové aktivační (gain-of-function) mutace genu PPM1D, které vedou k expresi zkráceného proteinu WIP1 z C-konce. Zkrácené varianty WIP1 jsou enzymaticky aktivní a vykazují se zvýšenou stabilitou proteinu v buňkách. V důsledku, že buňky mají více katalyticky aktivní WIP1, dochází k účinné inhibici p53 a k narušení kontrolního bodu v G1. Tyto mutace byly identifikovány v nádorových buněčných linií U2OS a HCT116 a také v periferní krvi pacientů s nádorem prsu a kolorektálním karcinomem. Navrhujeme, že tyto mutace genu PPM1D mohou predisponovat nositele k rozvoji rakoviny. V poslední části jsme in vitro validovali komerčně dostupné inhibitory WIP1 na buňkách s inaktivovaným genem PPM1D pomocí CRISPR-Cas9 technologie. Potvrdili jsme, že alosterický modulátor GSK2830371 specificky inhibuje WIP1 fosfatasu. Inhibice WIP1 významně snižuje proliferaci nádorových buněčných linií, které nesou amplifikaci PPM1D. Inhibice WIP1 neovlivnila proliferaci netransformovaných buněk, které mají nízkou hladinu WIP1 proteinu. Ukázali jsme, že inhibice WIP1 pomocí GSK2830371 zvyšuje citlivost buněk rakoviny prsu s amplifikací PPM1D a wild-type alelou p53 k účinkům drog způsobující DNA poškození a k antagonistům MDM2 (Nutlin-3). Ve snaze přispět k dalšímu poznání WIP1 fosfatasy jsme si také dali za cíl určit její krystalovou strukturu. Avšak do této doby se nám nepodařilo optimalizovat žádné krystalizační podmínky. Tato část je zahrnuta jako nepublikované výsledky. Ve shrnutí, získané výsledky během této doktorské práce přispívají k porozumění, jak WIP1 negativně reguluje DDR. WIP1 fosfatasa se podle našich výsledku jeví, jako vhodný farmakologický cíl, jehož inhibice může zvýšit odpověď nádorových buněk na chemoterapii.
Abstract v angličtině:
Abstract Cells in our body respond to genotoxic stress by activation of a conserved DNA damage response pathway (DDR). Depending on the level DNA damage, DDR signaling promotes temporary cell cycle arrest (checkpoint), permanent growth arrest (senescence) or programmed cell death (apoptosis). Checkpoints prevent progression through the cell cycle and facilitate repair of damaged DNA. DDR represents an intrinsic barrier preventing genome instability to protect cells against cancer development. WIP1 (encoded by PPM1D) phosphatase is a major negative regulator of DDR pathway and is essential for checkpoint recovery. This thesis contributed to the understanding of molecular mechanisms of WIP1 function and revealed how WIP1 can be involved in tumorigenesis. Firstly, we described that WIP1 protein levels decline during mitosis by APC-Cdc20 dependent proteasomal degradation. WIP1 is phosphorylated at multiple residues which inhibit its enzymatic activity. We propose that inhibition of WIP1 in mitosis allows sensing of low levels of DNA damage that appear during unperturbed mitosis. Further, we identified novel gain-of-function mutations of PPM1D which result in expression of C-terminally truncated WIP1. These truncated WIP1 variants are enzymatically active and exhibit increased protein stability. As result, cells have more of catalytically active WIP1 that impairs the p53-dependent G1 checkpoint. These mutations were identified in cancer cell lines U2OS and HCT116 and also in the peripheral blood of breast and colorectal cancer patients. We suggest that these gain- of-mutations of PPM1D could predispose to cancer development. Finally, we validated commercially available inhibitors of WIP1 using cells with a CRISPR/Cas9-mediated knock-out of PPM1D. We confirmed the specificity of a small-molecule allosteric modulator GSK2830371 towards WIP1. Specific inhibition of WIP1 significantly reduced the cell proliferation in cancer cell lines which carry amplification of PPM1D. WIP1 inhibition did not affect the proliferation of non-transformed cells with low levels of WIP1. Importantly, we showed that inhibition of WIP1 by GSK2830371 sensitizes breast cancer cells with amplified PPM1D and wild-type p53 to DNA damage-induced chemotherapy (doxorubicin) and to MDM2 antagonist (Nutlin- 3) treatment. In an effort to contribute the knowledge of WIP1 phosphatase we also aimed to determine its crystal structure. However, we have not optimized any crystallization condition for crystal growth. This part is included as unpublished results. In conclusion, the results obtained during the work on this thesis contribute to our knowledge of how the WIP1 negatively regulates DDR. Our results also support WIP1 phosphatase as a potential pharmacological target inhibition of which can sensitize cancer cells to chemotherapy.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Soňa Pecháčková 21.61 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Soňa Pecháčková 262 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Soňa Pecháčková 252 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Pavel Souček, CSc. 51 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Mgr. Lumír Krejčí, Ph.D. 812 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 139 kB