velikost textu

Lipid Membranes at the Nanoscale: Single-Molecule Fluorescence Approach

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Lipid Membranes at the Nanoscale: Single-Molecule Fluorescence Approach
Název v češtině:
Studium lipidových membrán v nanorozlišení pomocí fluorescenční detekce jednotlivých molekul
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Alena Koukalová
Školitel:
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
Oponenti:
RNDr. Jan Malínský, Ph.D.
Mgr. Aleš Benda, Ph.D.
Konzultant:
RNDr. Radek Šachl, Ph.D.
Id práce:
129195
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová a buněčná biologie (P1529)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
10. 12. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Zveřejnění práce bylo odloženo do 10.12.2021
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
fluorescence, membrány, nanodomény, lipopeptidy
Klíčová slova v angličtině:
fluorescence, membranes, nanodomains, lipopeptides
Abstrakt:
Abstrakt Komplexita buněčných membrán zdaleka není jen pouhé náhodné uskupení lipidů a proteinů, které odděluje buňku od okolního prostředí. Každá z tisíců různých složek membrán vykonává své specifické funkce důležité pro funkci celé buňky, neboť mnoho biologických procesů se odehrává právě na membránách. Pochopení těchto procesů na molekulové úrovni je cílem současného biologického výzkumu. Náš výzkum využívající detekci jednotlivých fluorescenčních molekul (např. FCS, FCCS, FLIM-FRET) přispěl k poznání laterální organizace membrán nebo mechanismu membránové fúze. Dále jsme odhalili mechanismus účinku membránově aktivního sekundárního metabolitu. Vzhledem k tomu, že je membránový systém živých buněk příliš složitý, byly naše experiment prováděny na modelových lipidových membránách, které umožňují studium lipid-lipidových a lipid-proteinových interakcí na molekulové úrovni kontrolovaným způsobem. První část této práce se zabývá studiem mechanismu působení sekundárního metabolitu didehydroroflamycoinu (DDHR) v membránách. Zjistili jsme, že DDHR je molekula tvořící póry v membránách a že je tato schopnost ovlivněna přítomností cholesterolu. Přímá vizualizace vlastní fluorescence DDHR ukázala jeho preferenční lokalizaci do oblastí membrán s vyšší uspořádaností lipidů. Druhá část práce je věnována studiu laterální heterogenity membrán v blízkosti fázového přechodu lipidů. Heterogenita membrán hraje významnou úlohu v mnoha buněčných procesech, její charakter však není dosud znám. Přestože konvenční fluorescenční mikroskopie neumožňuje přímou vizualizaci submikroskopických struktur, jejich existenci jsme zaznamenali pomocí různých technik založených na detekci jedné molekuly. Díky tomuto přístupu jsme identifikovali 9 nm velké fluidní nanodomény v GUV membránách o složení DOPC/Chol/SM a DOPC/SM. Dále jsme ukázali, že gangliosidy GM1 agregují a vytváří nanometrové domény a že je jejich přístupnost pro navázání ligandu B-podjednotky cholera toxinu ovlivněna denzitou GM1 molekul i přítomností cholesterolu. Třetí část této práce je zaměřena na studium komplementárních lipopeptidů CPnK4 a CPnE4, které mezi sebou vytváří tzv. “coiled-coil” vazbu a které slouží jako modelový systém pro fúzi membrán. Pokročilé fluorescenční metody nám umožnily studovat počáteční fáze membránové fúze zprostředkované těmito lipopeptidy. Ukázali jsme, že peptidová část lipopeptidu CPnE4 pouze přitáhne kladně nabitou peptidovou část lipopeptidu CPnK4 k membráně, což vede k přiblížení liposomů. Peptid K4 interaguje s membránou a způsobuje její deformace, což následně přispívá k membránové fúzi.
Abstract v angličtině:
Abstract The complexity of cell membranes is far from being only a simple assembly of lipids and proteins separating cells from the surrounding environment. Each of the thousands of different membrane components performs its specific role in cellular functions, since a multitude of biological processes is mediated by membranes. The understanding of the molecular basis of these processes is one of the important aims of current biological research. Our research employing single- molecule fluorescence methods (e.g. FCS, FCCS, FLIM-FRET) has made a contribution to the knowledge of membrane lateral organization or mechanism of membrane fusion. Furthermore, we revealed the mechanism of membrane activity of a small natural compound. As native cell membranes are very complex structures, we performed the experiments on simplified model lipid membranes that allow studying lipid-lipid or lipid-protein interactions at the molecular level in a controlled way. The first part of this thesis deals with the mode of action of a membrane active secondary metabolite didehydroroflamycoin (DDHR). We demonstrated that DDHR is a pore-forming agent and that this activity is influenced by the presence of cholesterol. Direct visualization of intrinsic fluorescence of DDHR revealed its preferential partitioning into membrane areas with higher lipid order. The second part concentrates on the membrane lateral heterogeneity close to the phase separation boundary. Membrane heterogeneity plays an important role in multiple cellular processes, but its nature is controversial. Although conventional fluorescence microscopy techniques do not allow direct visualization of these sub-microscopic structures, we were able to detect them by various single-molecule approaches. We identified approximately 9 nm sized fluid nanodomains in GUVs composed of ternary DOPC/Chol/SM and even in binary DOPC/SM lipid compositions. Furthermore, we showed that also ganglioside GM1 clusters into nanoscale domains and that its availability for binding by cholera toxin B subunit is influenced by GM1 density as well as by the presence of cholesterol. The third part is focused on investigation of complementary coiled-coil forming lipopeptides CPnK4 and CPnE4 that serve as a model system for membrane fusion. Single-molecule fluorescence techniques were employed to study their roles in the initial steps of the fusion process mediated by these lipopeptides. Our research revealed the asymmetrical nature of this fusion system. We proposed a model where the peptide moiety of the lipopeptide CPnE4 acts as a “handle” for positively charged peptide moiety of CPnK4 resulting in liposome docking, while the peptide K4 interacts with the membrane causing local deformations, which enhances the fusion process.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Alena Koukalová 31.88 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Alena Koukalová 211 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Alena Koukalová 209 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Alena Koukalová 238 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jan Malínský, Ph.D. 423 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Aleš Benda, Ph.D. 131 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 117 kB