velikost textu

Analyzing the role of the p130Cas SH3 domain in p130Cas-mediated signaling

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Analyzing the role of the p130Cas SH3 domain in p130Cas-mediated signaling
Název v češtině:
Analýza úlohy SH3 domény proteinu p130Cas v jeho signalizaci
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Jakub Gemperle
Školitel:
RNDr. Daniel Rösel, Ph.D.
Oponenti:
Ing. Tomáš Vomastek, Ph.D.
Mgr. Jaroslav Truksa, Ph.D.
Id práce:
128319
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová a buněčná biologie (P1529)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
10. 12. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
p130Cas, SH3, Src, PKN3, Vinculin
Klíčová slova v angličtině:
p130Cas, SH3, Src, PKN3, Vinculin
Abstrakt:
SUMMARY IN CZECH Adaptorový protein p130Cas (CAS, BCAR1) propojuje signalizaci od integrinových receptorů s receptory růstových faktorů a ovlivňuje správný embryonální vývoj a tkáňovou homeostázu. Jeho změněná exprese může vyvolat mnoho patologických stavů, včetně nádorového bujení, metastazování a rezistence vůči různým protinádorovým lékům. Molekulární mechanismy, jakými p130Cas přispívá k různým patologickým stavům nejsou zatím jednoznačně popsány. Cílem mé doktorské práce bylo tedy poskytnout nové poznatky o signalizaci p130Cas a o její regulaci. Doména SH3 je nepostradatelná pro signalizaci proteinu p130Cas, ale její vazebné preference/regulace nebyly dosud přesně charakterizovány ani strukturně popsány. Proto jsme začali spolupracovat se skupinou Dr. Veverky (Strukturní biologie) a Dr. Lepšíkem (Výpočetní biochemie, AV ČR). S jejich pomocí jsme pak připravili fúzní chiméry SH3 domény proteinu p130Cas se svými ligandy a provedli strukturní analýzu NMR, která nám pomohla strukturně popsat atypický vazebný motiv SH3 domény proteinu p130Cas. Díky této spolupráci jsem se navíc naučil, jak tyto struktury vizualizovat a analyzovat. Tato práce rozšířila naše znalosti o regulaci vazby mezi p130Cas SH3 a jejími ligandy a dále vedla k vylepšenému modelu vazby mezi Src-p130Cas-FAK. Naše snaha sledovat aktivitu kinázy Src a její konformaci, která ovlivňuje, jak Src fosforyluje p130Cas, vedla k vytvoření nového biosenzoru Src na bázi FRET. Díky tomu jsem si vyzkoušel pokročilou zobrazovací mikroskopickou techniku FRET. Navíc jsem vyvinul pracovní postup, který nám umožnil nalézt nové přímé vazebné partnery p130Cas a identifikovat DOK7, GLIS2 a PKN3, a také pomohl validovat přímou vazbu s Vinculinem. U interakce p130Cas-Vinculin jsme dále prokázali, že má důležitou roli v přenosu mechanického napětí a na dynamiku fokálních adhezí. Interakce s DOK7 a GLIS2 přinesla nový vhled do možných procesů vedoucích k neuromuskulárním a ledvinovým patologiím. Na závěr jsem pomohl prokázat, že p130Cas interaguje se Ser/Thr kinázou PKN3 v pro-invazivních buněčných invadopódiích/lamellipodiích a ukázal, že tato interakce je důležitá pro růst a invazivitu myších embryonálních fibroblastů. Oboje bylo nezávislé na transformaci kinázou Src, což poukazuje na nový mechanismus, který je odlišný od dříve prokázaného pro p130Cas. Fyziologický význam těchto zjištění jsem dále podpořil analýzou proteomických dat z nádorů od pacientů s rakovinou prsu, která poskytla důkaz, že PKN3 fosforyluje p130Cas u invazivních nádorů prsu.
Abstract v angličtině:
SUMMARY The adaptor protein p130Cas (CAS, BCAR1) represents a nodal signaling platform for integrin and growth factor receptor signaling, and influences normal development and tissue homeostasis. Its altered expression drives many pathological conditions including tumor growth, metastasis and drug resistance in many cancer types. How p130Cas contributes to many of these pathologies is still poorly understood. Therefore, the overall aim of my PhD work was to provide new insights to p130Cas signaling and its regulation. The SH3 domain is indispensable for p130Cas signaling, but the ligand binding characteristics of the p130Cas SH3 domain, and the structural determinants of its regulation were not well understood. To be able to study various aspects of p130Cas signaling we identified an atypical binding motif in p130Cas SH3 domain by establishing collaborations with Dr Veverka (Structural biology) and Dr Lepšík (Computational biochemistry; Academy of Sciences, CZ) which gave new insight into this binding interface. Through these collaborations I generated chimeras of p130Cas SH3 domain with its ligands for structural NMR analysis and learned how to visualize and analyze structures. Furthermore, my work expanded our knowledge of p130Cas SH3 ligand binding regulation and led to a novel model of Src-p130Cas- FAK binding. Our efforts to monitor Src kinase activity and conformation, which influence how Src phosphorylates p130Cas, led us to construct a novel FRET-based Src biosensor and allowed me to use cutting edge FRET imaging. In addition, I developed a bioinformatic workflow to identify novel direct p130Cas binding partners that led to identification DOK7, GLIS2 and PKN3, and helped to validate direct binding to Vinculin. Vinculin-p130Cas interaction was further demonstrated to have a crucial role in mechanosensing and focal adhesion dynamics, and the interaction with DOK7 and GLIS2 gave insight into neuromuscular and kidney pathologies. Finally, I helped to demonstrate that p130Cas interacts with Ser/Thr kinase PKN3 in pro-invasive cell invadopodia/lamellipodia and showed that this interaction is important for mouse embryonic fibroblast growth and invasiveness independent of Src transformation, indicating a mechanism distinct from that previously suggested for p130Cas. I further showed the relevance of this work to human breast cancer combining in vitro work with analysis of proteomic data to provide evidence that PKN3 phosphorylates p130Cas in invasive breast tumors.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jakub Gemperle 17.63 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jakub Gemperle 94 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jakub Gemperle 89 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Jakub Gemperle 241 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Daniel Rösel, Ph.D. 100 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Tomáš Vomastek, Ph.D. 193 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Jaroslav Truksa, Ph.D. 725 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 110 kB