velikost textu

Study of conformations and conformational changes of proteins using mass spectrometric methods.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Study of conformations and conformational changes of proteins using mass spectrometric methods.
Název v češtině:
Studium konformací a konformačních změn proteinů metodami hmotnostní spektrometrie.
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Alan Kádek
Školitel:
RNDr. Petr Man, Ph.D.
Oponenti:
prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., Ph.D. et Ph.D.
Ing. Aleš Hnízda, Ph.D.
Id práce:
128259
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
19. 9. 2016
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRAKT Hmotnostně spektrometrické (MS) techniky si v průběhu posledních dvou desetiletí našly své trvalé místo mezi nástroji strukturní biologie. Kromě získání informace o primární sekvenci proteinů jsou stále častěji využívány i pro studium vyšší strukturní organizace bílkovin. Nedosahují sice atomárního prostorového rozlišení, jsou ale naopak prosty řady experimentálních omezení. MS strukturní techniky tak jsou schopny studovat molekuly za nativních podmínek v roztoku, jsou rychlé, mají nízkou spotřebu vzorku a jsou použitelné pro molekuly a jejich komplexy s velmi širokým rozsahem velikostí. Možná nejdůležitější je však jejich schopnost poskytnout informace o konformační dynamice proteinů, které tak mohou doplnit data získaná jinou strukturní technikou s vyšším prostorovým rozlišením v rámci integrativní strukturní biologie. V této disertační práci byla hlavní pozornost věnována technice vodík / deuteriové výměny v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (HXMS), která je jednou z nejvíc rozšířených strukturních MS metod. Rekombinantně připravená aspartátová proteasa nepenthesin-1 z láčkovek rodu Nepenthes byla charakterizována, imobilizována a podrobně testována s cílem rozšířit portfolio proteas dostupných pro HXMS experimenty a zvýšit prostorové rozlišení této techniky. Po úspěšné implementaci do HXMS experimentálního protokolu byl nepenthesin-1 využit v kombinaci s rhizopuspepsinem při analyticky náročném studiu vysoce flexibilního proteinu celobiosadehydrogenasy (CDH). Tento biotechnologicky zajímavý protein byl zkoumán s cílem strukturně objasnit mechanismy regulace jeho aktivity pomocí pH a divalentních kationtů. Za tímto účelem byla metoda HXMS doplněna nativní hmotnostní spektrometrií s iontovou mobilitou a výpočetním modelováním distribuce elektrostatického náboje na povrchu proteinů. Společně tyto strukturní MS a výpočetní techniky přinesly zajímavé poznatky o analýze transientních proteinových komplexů. Zejména ale poskytly přímý experimentální důkaz, že repulse oblastí negativního náboje v blízkosti mezidoménového rozhraní CDH je klíčovým mechanismem řídícím fungování tohoto enzymu. Klíčová slova: Strukturní hmotnostní spektrometrie, nepenthesin-1, vodík / deuteriová výměna s MS (HXMS), nativní hmotnostní spektrometrie s iontovou mobilitou (IMMS), aspartátové proteasy, imobilizace proteinů, celobiosadehydrogenasa (CDH), elektrostatika povrchu proteinu, flavocytochrom, přímý přenos elektronů.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Mass spectrometry (MS) techniques have, over the last twenty years, found their stable place in the structural biology toolkit. They are not only employed to provide information on the protein primary sequence, but are increasingly used to probe higher orders of protein structure as well. They may not boast the atomic resolution and the ability to directly provide structural coordinates, but on the other hand suffer from very few experimental limitations as they are able to work under native conditions in solution, provide data fast, with low sample consumption and for proteins and complexes of vastly differing sizes. Perhaps most importantly, they may often be employed to study conformational dynamics of proteins and can thus complement other methods with higher spatial resolution in integrative structural biology approaches. The main focus of this Ph.D. thesis was hydrogen / deuterium exchange coupled to MS (HXMS), which is one of the most widespread structural MS methods. Recombinantly produced aspartic protease nepenthesin-1 from Nepenthes pitcher plants was characterized, immobilized and extensively tested with the intention to expand the portfolio of aspartic proteases in HXMS workflow and to improve the spatial resolution of the technique. Following successful implementation of nepenthesin-1 into the HXMS protocol, it was used in combination with rhizopuspepsin in analyses of a challenging highly-flexible cellulolytic enzyme cellobiose dehydrogenase (CDH). This biotechnologically interesting protein was studied in order to obtain structural explanation for the regulation of its activity by pH and divalent cations. For this, HXMS was complemented by native MS with ion mobility and protein surface electrostatics calculations. Together, the structural MS and computational techniques brought some interesting observations concerning the analyses of transient protein complexes. Moreover, they provided a direct experimental proof that repulsion of negative charge patches close to interdomain interface in CDH is the key mechanism governing its functioning in solution. Keywords: Structural mass spectrometry, nepenthesin-1, hydrogen / deuterium exchange mass spectrometry (HXMS), native mass spectrometry with ion mobility (IMMS), aspartic protease, protein immobilization, cellobiose dehydrogenase (CDH), protein surface electrostatics, flavocytochrome, direct electron transfer.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Alan Kádek 30.73 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Alan Kádek 232 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Alan Kádek 12 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Alan Kádek 3.08 MB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., Ph.D. et Ph.D. 277 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Aleš Hnízda, Ph.D. 1.1 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 686 kB