velikost textu

Study of function and molecular architecture of fungal nitrilases applicable in biocatalysis

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Study of function and molecular architecture of fungal nitrilases applicable in biocatalysis
Název v češtině:
Studium funkce a molekulární architektury fungálních nitrilas využitelných v biokatalýze
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Alicja Barbara Veselá
Školitel:
Ing. Ludmila Martínková, CSc.
Oponenti:
prof. Ing. Tomáš Macek, CSc.
Ing. Jan Teisinger, CSc.
Id práce:
117597
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
15. 10. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
nitrilasy, nitrily, heterologní exprese, substrátová specifita, strukturní analýza, cílená mutageneze, biokatalýza
Klíčová slova v angličtině:
nitrilase, nitriles, heterologous expression, substrate specificity, structural analysis, site-directed mutagenesis, biocatalysis
Abstrakt:
Nitrilasy jsou enzymy katalyzující hydrolýzu nitrilů na příslušné karboxylové kyseliny a amonné ionty. Tyto enzymy mohou nalézt využití v biokatalýze a bioremediaci pro vyšší nenáročnost, bezpečnost a jednoduchost takto katalyzovaných reakcí před konvenčními metodami hydrolýzy nitrilů. V této práci byly pomocí metody prohledávání databazí vybrány sekvence hypotetických fungálních nitrilas. Jako templáty posloužily aminokyselinové sekvence fungálních nitrilas již dříve charakterizovaných v naší laboratoři. Následně byly nové syntetické geny spolu se zbylými geny z naší nitrilasové knihovny exprimovány v E. coli a poté byly porovnány jejich substrátové specifity a podobnost sekvencí. Arylacetonitrilasy z hub Arthroderma benhamiae (NitAb) a Nectria haematococca (NitNh) byly purifikovány a charakterizovány; byly stanoveny jejich substrátové specifity, kinetické parametry, pH a teplotní profily a velikost podjednotek. NitAb a NitNh spolu s dalšími rekombinantními fungálními nitrilasami byly použity pro hydrolýzu vysokých koncentrací (R,S)-mandelonitrilu v jedné dávce nebo s postupným dávkováním substrátu. Ze studovaných enzymů nitrilasa z Aspergillus niger vykázala nejlepší enantioselektivitu (e.e. pro (R)-mandlovou kyselinu až 97,6 %) a produktivitu enzymu v sušině (až 40 g gsuš -1). NitAb byla pouze mírně enantioselektivní, čehož se však dá v kombinaci s její stabilitou pri nízkém pH využít pro produkci (S)-mandlové kyseliny. Soubor našich rekombinantních fungálních arylacetonitrilas byl rovněž testován na schopnost hydrolyzovat (±)-trans-2,4-difenyl-4,5-dihydrooxazol-5-karbonitril (příslušná karboxyová kyselina je prekurzorem taxolu, jež se používá jako protinádorové léčivo). Všechny enzymy dosáhly plné konverze 1 mM substrátu běhm 1 nebo 22 hodin. Nitrilasa z houby Neurospora crassa byla nejvíce aktivní a byla použita při preparativní přípravě (±)-trans-2,4-difenyl-4,5-dihydrooxazol-5-karboxylové kyseliny.
Abstract v angličtině:
Nitrilases are enzymes which catalyze the hydrolysis of a nitrile into the corresponding carboxylic acid and ammonia. These enzymes are potentially applicable in biocatalysis and bioremediation because of their advantages over the conventional (chemical) methods of nitrile hydrolysis (lower demand for energy, safety, simplicity, high yields, selectivity). In this work, genome mining was used to search for the sequences of hypothetical nitrilases from filamentous fungi. The amino acid sequences of previously characterized fungal nitrilases were used as the templates. Then the new synthetic genes together with other genes from our nitrilase library were expressed in E. coli and the substrate specificities of the enzymes thus produced were compared. Significant attention was focused on the relationships between the sequence of the enzyme and its substrate specificity. The arylacetonitrilases from Arthroderma benhamiae (NitAb) and Nectria haematococca (NitNh) were purified and characterized. Their substrate specificities, kinetic parameters, pH and temperature profiles and subunit and holoenzyme size were assessed. NitAb and NitNh together with other recombinant fungal nitrilases were employed in the hydrolysis of high concentrations of (R,S)-mandelonitrile in a batch or fed-batch mode. Nitrilase from Aspergillus niger displayed the best results in enantioselectivity, enabling to prepare (R)-mandelic acid with 97.6 % e.e., and in catalyst productivity of 40 g of the product per g of dry cell weight. NitAb displayed a moderate enantioselectivity, which, together with its stability at low pH, make it applicable in the production of (S)-mandelic acid from (S)-mandelonitrile. A set of recombinant fungal arylacetonitrilases was tested in hydrolysis of (±)-trans-2,4-diphenyl-4,5-dihydrooxazole-5-carbonitrile. The corresponding carboxylic acid is a precursor of taxol, an anti-cancer drug. All tested enzymes displayed a complete conversion of 1 mM substrate within 1-22 hours. Nitrilase from Neurospora crassa was the most active and was thus used for the preparative-scale synthesis of (±)-trans-2,4-diphenyl- 4,5-dihydrooxazole-5-carboxylic acid.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Alicja Barbara Veselá 2.35 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Alicja Barbara Veselá 2.17 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Alicja Barbara Veselá 178 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Alicja Barbara Veselá 175 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Alicja Barbara Veselá 629 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Tomáš Macek, CSc. 145 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jan Teisinger, CSc. 84 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1 MB
Stáhnout Errata Mgr. Alicja Barbara Veselá 380 kB