velikost textu

Molecular mechanisms of checkpoint signalling and termination

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Molecular mechanisms of checkpoint signalling and termination
Název v češtině:
Molekulární mechanismy signalizace a terminace checkpointu
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Jan Benada
Školitel:
MUDr. Libor Macůrek, Ph.D.
Oponenti:
doc. RNDr. Jan Brábek, Ph.D.
Mgr. Jaroslav Truksa, Ph.D.
Konzultant:
prof. MUDr. Jiří Bartek, DrSc.
Id práce:
117126
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
14. 2. 2017
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Wip1, PPM1D, 53BP1, Plk1, kontrolní bod buněčného cyklu, odpověď na poškození DNA
Klíčová slova v angličtině:
Wip1, PPM1D, 53BP1, Plk1, checkpoint, DNA damage response
Abstrakt:
Abstrakt Pro udržení integrity genomu využívají buňky extensivní signální síť nazývanou buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response). DDR je schopná aktivovat kontrolní body buněčného cyklu (checkpoints), které brání dalšímu průchodu buněčným cyklem a umožňují buňce opravit poškozenou DNA. Poruchy těchto ochranných mechanismů se projevují závažnými lidskými onemocněními, především rozvojem rakoviny. Cílem teto práce je přispět k porozumění toho jak buňky negativně regulují DDR a signalizaci kontrolních bodu buněčného cyklu. Zaměřili jsme se zejména na fosfatázu Wip1 (PPM1D), která je hlavním negativním regulátorem DDR a je nezbytná pro zotavení z kontrolních bodu. Nejprve jsme ukázali, že Wip1 je degradovaná během mitózy APC- Cdc20-dependetním mechanismem. Wip1 je dále v průběhu mitózy fosforylována na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice Wip1 umožňuje buňkám adekvátně reagovat i na nízkou hladinu poškození DNA, ke kterému dochází i při nenarušené mitóze. V následující publikaci jsme se zabývali tím, proč mitotické buňky spouštějí pouze časnou DDR a nepokračují k akumulaci opravných faktoru jako je 53BP1. Ukázali jsme, že 53BP1 je fosforylován kinázami CDK1 a Plk1 uvnitř motivu, který je zodpovědný za jeho vazbu na ubiquitin. Tyto fosforylace brání 53BP1 vázat se na ubiquitinované histony, dostat se do míst poškození DNA a ve výsledku brání efektivní opravě DNA. V zahrnutých nepublikovaných datech jsme ukázali, ze Wip1 je po genotoxickém stresu fosforylovaná kinázami MK2 a p38. Funkční význam těchto fosforylací je však třeba dále objasnit. V další části práce jsme identifikovali nové aktivační (gain-of-function) mutace genu PPM1D, které způsobují expresi C-terminálně zkráceného proteinu Wip1. Zkrácená varianta Wip1 je katalyticky aktivní a vykazuje zvýšenou stabilitu. Ve výsledku mají tedy buňky více katalyticky aktivní Wip1, která účinně vypíná p53-dependentí kontrolní bod v G1. Tyto mutace jsme objevili v buněčných linií U2OS a HTC116 a rovněž v periferní krvi pacientů s rakovinou prsu a konečníku. Navrhujeme, že tyto mutace mohou predisponovat nositele k rozvoji rakoviny. Nakonec jsme in vitro ukázali, že inhibice Wip1 drogou GSK2830371 specificky senzitizuje buňky rakoviny prsu s amplifikací PPM1D a wild-type alelou p53 k účinkům drog poškozujících DNA a k antagonistům Mdm2, jako je Nutlin-3. Ve shrnutí, získané výsledky přispívají k porozumění toho jak buňky negativně regulují DDR. Věříme, že lepší porozumění molekulárních mechanismů DDR přispěje k lepší diagnostice a vývoji cílených léčiv proti rakovině.
Abstract v angličtině:
Abstract Cells employ an extensive signalling network to protect their genome integrity, termed DNA damage response (DDR). The DDR can trigger cell cycle checkpoints which prevent cell cycle progression and allow repair of DNA damage. The failures in these safeguarding mechanism are represented by serious human malignancies, most predominantly by cancer development. This work aims to contribute to the understanding of how do the cells negatively regulate DDR and cell cycle checkpoint signalling. We focused mainly on Wip1 (PPM1D) phosphatase, which is a major negative regulator of DDR and is indispensable for checkpoint recovery. Firstly, we have shown that Wip1 is degraded during mitosis in APC-Cdc20 dependent manner. Moreover, Wip1 is phosphorylated at multiple residues during mitosis, resulting in inhibition of its enzymatic activity. We suggest that the abrogation of Wip1 activity enables cells to react adequately even to low levels of DNA damage encountered during unperturbed mitosis. In the following publication, we have investigated why the mitotic cells trigger only early events of DDR and do not proceed to the recruitment of DNA repair factors such as 53BP1. We showed that 53BP1 is phosphorylated within its ubiquitination-dependent recruitment domain by CDK1 and Plk1. These phosphorylations prevents 53BP1 to bind ubiquitinated histones, to localize to sites of DNA damage and ultimately hampers DNA repair. In included unpublished results we showed that Wip1 is phosphorylated upon genotoxic stress by MK2 and p38 kinases. The functional relevance of these modifications still remains to be elucidated. In next part, we identified novel gain-of-function mutations of PPM1D which result in expression of C-terminally truncated Wip1. The truncated Wip1 retains its catalytic activity, while exhibit increased protein stability. As result, cells have more of catalytically active Wip1, that efficiently shut down the p53-dependent G1 checkpoint. These mutations were identified in cancer cell lines U2OS and HCT116 and importantly also in peripheral blood of breast and colorectal cancer patients. We propose that these mutations could predispose to cancer development. Finally, we showed in vitro that inhibition of Wip1 by small molecule drug GSK2830371 specifically sensitizes breast cancer cells with amplified PPM1D and wild-type p53 to chemotherapy treatment with DNA damaging drugs and to Mdm2 antagonist such as Nutlin3. In conclusion, the results obtained during the work on this thesis contribute to our knowledge of how the cells negatively regulate DDR. We believe that better understanding to molecular regulation of DDR will eventually lead to better diagnostics and to development of more targeted cancer treatments.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jan Benada 26.81 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jan Benada 44 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jan Benada 43 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Jan Benada 1.13 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Brábek, Ph.D. 148 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Jaroslav Truksa, Ph.D. 390 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 724 kB