velikost textu

Mechanismus regulace funkce fosducinu

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Název v angličtině:
The mechanism of the regulation of phosducin function
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Miroslava Kacířová
Školitel:
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Oponenti:
RNDr. Jan Krůšek, CSc.
RNDr. Jiří Pavlíček, Ph.D.
Id práce:
117028
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Program studia:
Fyzikální chemie (P1404)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
13. 12. 2016
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
fosducin, 14-3-3, fluorescence, interakce, struktura
Klíčová slova v angličtině:
phosducin, 14-3-3, fluorescence, interaction, structure
Abstrakt:
Abstrakt Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR, H/D výměny spojené s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) či metod fluorescenční spektroskopie. Získané výsledky ukázaly, že N-terminální doména Pdc (Pdc-ND) je vnitřně nestrukturovaný protein. Fosforylace Pdc ovlivňuje konformaci nejen v rámci Pdc-ND, kde se nacházejí obě fosforylační místa, ale i v rámci strukturované C-terminální domény (Pdc-CD). Protein 14-3-3 váže Pdc-PP s mikromolární vazebnou afinitou a tvorba komplexu ovlivňuje konformaci a snižuje flexibilitu zejména fosforylované Pdc-ND. Obě fosforylační místa Pdc jsou klíčová pro vazbu proteinu 14-3-3. Velká část Pdc-ND, která tvoří většinu vazebného povrchu Pdc pro Gtβ, se v komplexu se 14-3-3 nachází buď v centrálním kanálu molekuly dimeru 14-3-3, nebo v blízkosti jeho povrchu. Vazba 14-3-3 tedy blokuje vazebný povrch Pdc pro Gtβ a tím inhibuje tuto interakci. NMR a HDX-MS měření dále ukázala, že Pdc-PP zůstává i po navázání na protein 14-3-3 flexibilní, což naznačuje, že by se mohlo jednat o tzv. „fuzzy“ komplex. Získané výsledky také naznačují, že vazba proteinu 14-3-3 zpomaluje defosforylaci Pdc-PP.
Abstract v angličtině:
Abstract This dissertation is focused on 30 kDa protein phosducin (Pdc) and on the regulation of its function through the interaction with 28 kDa adaptor protein 14-3-3. These two proteins participate in G-protein signal transduction pathways, especially in the process of light signal transduction. It is assumed that Pdc binds to the Gtβγ complex of G-protein called transducin and through this interaction it inhibits the reassociation of Gtβγ with Gtα thus reducing the visual signal transfer. This process is thought to participate in a long- term light adaptation. The regulation of Pdc function is further regulated by its phosphorylation and subsequent binding to the 14-3-3 protein. It has been speculated that the 14-3-3 binding plays a key role in the inhibition of the interaction between phosphorylated Pdc (Pdc-PP) and Gtβγ. The formation of the 14-3-3/Pdc-PP complex leads to the reassociation of Gtβγ with Gtα and consequently to the amplification of visual signal transfer. Nevertheless, the mechanism by which the 14-3-3 protein binding inhibits the interaction between Pdc and Gtβγ remains elusive. The main aims of this dissertation were: (i) to investigate the structure of Pdc in its apo-state (in the absence of the binding partner) and in the complex with 14-3-3, and (ii) to suggest the mechanism of the 14-3-3-mediated regulation of Pdc function. The structure of Pdc and the 14-3-3/Pdc-PP complex was studied using various biophysical methods including small-angle X-ray scattering (SAXS), NMR, H/D exchange coupled to mass spectrometry (HDX-MS) and fluorescence techniques. Our data suggested that the N-terminal domain of Pdc (Pdc-ND) is intrinsically disordered protein. The phosphorylation of Pdc affects conformation of both its domains - unstructured Pdc-ND as well as structured C-terminal domain (Pdc-CD). The 14-3-3 protein binds Pdc-PP with the binding affinity in micromolar range and the complex formation affects the conformation of Pdc especially within Pdc-ND. Both phosphorylation sites are essential for the complex formation. The majority of Pdc-ND, which accounts for the most of the Gtβ binding surface, is located either in the central channel of the 14-3-3 dimer or in the close vicinity of the 14-3-3 outer surface. Therefore, our data suggest that the 14-3-3 binding masks the majority of the Gtβ binding surface of Pdc and thus inhibits its interaction with Gtβ. In addition, NMR and HDX-MS measurements revealed that Pdc-PP remains highly flexible after the 14-3-3 binding, which indicates the formation of a “fuzzy” complex. Our data also showed that the 14-3-3 binding slows down dephosphorylation of Pdc-PP in vitro.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Miroslava Kacířová 4.89 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Miroslava Kacířová 24.7 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Miroslava Kacířová 112 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Miroslava Kacířová 100 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Miroslava Kacířová 1.44 MB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jan Krůšek, CSc. 83 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jiří Pavlíček, Ph.D. 208 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 569 kB