velikost textu

Mechanismus enzymové aktivace karcinogenů a léčiv systémem cytochromů P450

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Mechanismus enzymové aktivace karcinogenů a léčiv systémem cytochromů P450
Název v angličtině:
Mechanism of enzymatic activation of carcinogens and drugs by the system of cytochrome P450
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Radek Indra
Školitel:
prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.
Oponenti:
RNDr. Pavel Souček, CSc.
RNDr. Jitka Koblihová
Id práce:
116905
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
4. 6. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
cytochrom P450, cytochrom b5, NADPH:cytochrom P450 reduktasa, NADH:cytochrom b5 reduktasa, benzo[a]pyren
Klíčová slova v angličtině:
cytochrome P450, cytochrome b5, NADPH:cytochrome P450 reductase, NADH:cytochrome b5 reductase, benzo[a]pyrene
Abstrakt:
Abstrakt Abstrakt Environmentální polutant benzo[a]pyren (BaP) je prokazatelným lidským karcinogenem, který se po aktivaci cytochromy P450 (CYP) kovalentně váže na DNA. V rámci dizertační práce byl studován vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO), systému lokalizovanému v membráně endoplasmatického retikula, na metabolismus benzo[a]pyrenu a na tvorbu aduktů BaP s DNA. Zaměřili jsme se především na porovnání vlivu cyt b5 na tento metabolismus a potenciál cyt b5 sloužit jako donor elektronů v rámci reakčního cyklu cytochromu P450 1A1. Tento vliv byl studován jednak z pohledu tvorby metabolitů BaP, a jednak z pohledu tvorby jeho aduktů s DNA. Byl také studován vliv dvou expresních systémů pro cytochrom P450 1A1 (prokaryotický a eukaryotický), na jeho účinnost v metabolismu BaP. Vliv cyt b5 na účinnost monooxygenasového systému byl studován i s další cizorodou látkou, rostlinným alkaloidem ellipticinem, jenž vykazuje protinádorové účinky. Jeho protinádorový efekt, stejně jako vedlejší účinky, závisí na jeho metabolické aktivaci cytochromy P450. Významný z tohoto hlediska je zejména CYP3A4. Ten byl proto použit i v našich experimentech. Dále byla v práci studována vhodnost laboratorního potkana sloužit jako model metabolického osudu BaP v lidském organismu. Při studiu metabolismu obou testovaných látek byla k separaci metabolitů použita vysokoúčinná chromatografie (HPLC). Adukty s DNA vzniklé aktivací BaP byly kvantifikovány metodou „32P-postlabeling“. Ze získaných výsledků sledujících potenciál potkana sloužit jako model metabolického osudu BaP v lidském organismu je zřejmé, že lidské a potkaní jaterní mikrosomy přeměňují BaP na téměř analogické metabolity, s výjimkou tvorby BaP-9-olu, který v případě lidských mikrosomů nebyl tvořen. Metabolity generované potkaním CYP1A1 se od metabolitů tvořených lidským CYP1A1 liší také tvorbou BaP-4,5-dihydrodiolu v potkaním systému. Ostatní metabolity jsou pro enzymy obou organismů shodné. To naznačuje vhodnost laboratorního potkana jako modelového organismu pro studium metabolického osudu BaP u člověka. Enzym epoxidhydrolasa je esenciální pro tvorbu dihydrodiolů BaP a jednoho ze dvou majoritních aduktů tvořených aktivací BaP cytochromem P450 1A1 s DNA. Její absence v prokaryotním expresním systému pro CYP1A1 (Bactosomech) limitovala použití tohoto systému pro studium metabolismu BaP oproti eukaryotnímu expresnímu systému pro tento enzym (SupersomyTM). Cyt b5 stimuloval tvorbu metabolitů BaP katalyzovanou CYP1A1 i aduktů BaP s DNA po aktivaci těmito enzymy. Výsledky získané v dizertační práci prokazují, že redukci CYP1A1 v jeho reakčním cyklu, při kterém je oxidován BaP, může poskytovat elektrony nejen systém NADPH a NADPH:CYP reduktasy, ale i systém NADH, NADH: cytochrom b5 reduktasy a cytochromu b5. A to v obou redukčních krocích. Schopnost cyt b5 poskytovat oba elektrony cytochromu P450 (CYP3A4) byla pozorována i při studiu vlivu cyt b5 na metabolismus ellipticinu. 12
Abstract v angličtině:
Abstract Abstract An environmental pollutant and a human carcinogen benzo[a]pyrene (BaP) is after its activation with cytochrome P450 (CYP) able to covalently bind to DNA. In the thesis, one of the target was to investigate an influence of individual components of mixed function monooxygenase (MFO) system on metabolism of benzo[a]pyrene and generation of adducts of activated BaP with DNA. The study was particularly focused to increase our knowledge on the effect of cyt b5 on metabolism of BaP by cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) and its potential to serve as a donor of electrons during the reaction cycle of this cytochrome P450. The effect of cyt b5 on generation of BaP metabolites and adducts of BaP with DNA was investigated. In addition the effect of two different expression systems for cytochrome P450 1A1 (prokaryotic and eukaryotic) was also studied. The influence of cyt b5 on oxidation another xenobiotic compound, a plant alkaloid ellipticine that exhibit antitumor activities, was also investigated. Its pharmacological efficiency, as well as side effects depends on its metabolic activation by cytochrome P450. CYP3A4 is very important for ellipticine activation and therefore this enzyme was used in our experiments. Furthermore, a suitability of rat as a model organism mimicking the metabolic fate of BaP in human was studied. High performance liquid chromatography (HPLC) was used for separation of metabolites of both compounds. DNA adducts generated by BaP activated by CYPs were analysed by the “32P-postlabeling” method. The results found in a study investigating the potential of rats to serve as a model organism mimicking a metabolic fate of BaP in humans indicate that human and rat microsomes generate almost the same metabolites, with the only exception of a metabolite BaP-9-ol. This metabolite was not formed by human microsomes. Metabolites generated by rat CYP1A1 differ from metabolites generated by human CYP1A1 also by formation of BaP- 4,5-dihydrodiol. This metabolite is not formed by human CYP1A1. Other BaP metabolites generated by rat and human CYP1A1 are identical. This finding indicates that rat is a suitable model mimicking metabolism of BaP in human. Epoxide hydrolase was shown to be the essential enzyme for generation of dihydrodiols of BaP and one of the BaP-DNA adducts. Its lack in a prokaryotic expression system for CYP1A1 (Bactosomes) limited this system to be used for a study of the metabolic fate of BaP and preferred the eukaryotic system expressing CYP1A1 (SupersomesTM). Cyt b5 stimulates generation of BaP metabolites and BaP-DNA adduct formation by rat and human CYP1A1. The results found in thesis show that the system of human CYP1A1, NADH, NADH:cytochrome b5 reductase and cytochrome b5 is able to metabolize BaP and to generate BaP-DNA adducts. They also demonstrate that NADH in this system can act as a sole electron donor both for the first and the second reduction of CYP1A1 during oxidative activation of BaP in vitro. The ability of cyt b5 donates both electrons to CYP enzyme was also observed in oxidation of ellipticine by human CYP3A4. 13
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Radek Indra 2.26 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Radek Indra 3.61 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Radek Indra 78 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Radek Indra 76 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Radek Indra 911 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Pavel Souček, CSc. 132 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jitka Koblihová 263 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1.02 MB