velikost textu

Syntéza lidských ω-O-acylceramidů a hodnocení jejich vlivu na bariérové vlastnosti kožních lipidových membrán

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Syntéza lidských ω-O-acylceramidů a hodnocení jejich vlivu na bariérové vlastnosti kožních lipidových membrán
Název v angličtině:
Synthesis of human ω-O-acylceramides and evaluation of their effects on barrier properties of skin lipid membranes
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lukáš Opálka
Školitel:
Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D.
Oponenti:
doc. Ing. František Hampl, CSc.
Mgr. Norbert Kučerka, Ph.D.
Konzultant:
Mgr. Petra Pullmannová, Ph.D.
Id práce:
116667
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra organické a bioorganické chemie (16-16120)
Program studia:
Organická chemie (P1402)
Obor studia:
Bioorganická chemie (DB4)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
27. 9. 2016
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra anorganické a organické chemie Kandidát: Mgr. Lukáš Opálka Školitel: doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Název disertační práce: Syntéza lidských ω-O-acylceramidů a hodnocení jejich vlivu na bariérové vlastnosti kožních lipidových membrán Hlavním cílem této práce bylo připravit a dále studovat lidské acylceramidy (acylCer, ceramidy typu EO) se zaměřením na objasnění vztahu mezi koncentrací acylCer, strukturou jejich polární hlavy, schopností tvořit lamelární fáze a permeabilitou modelových lipidových membrán. Dalším cílem bylo připravit ceramid-1-fosfáty pro studium jejich signalizační role v kožní bariéře a analog gangliosidu GM1 s kratším acylem jako standard pro analýzu těchto lipidů. Ceramidy (Cer) patří do rodiny sfingolipidů. Jsou to centrální molekuly v metabolismu sfingolipidů a podílejí se jak na regulačních procesech v buňkách, tak na bariérové funkci lidské kůže. Hlavní kožní bariéru představuje stratum corneum (SC), což je nejsvrchnější vrstva kůže. Účelem SC je udržet homeostázu vnitřního prostředí a zabránit průniku exogenních látek, alergenů a bakterií do organismu. AcylCer se skládají ze sfingoidní báze, která je acylována ultra-dlouhou (≥ 30C) kyselinou, na jejíž ω-hydroxylové skupině je vázaná kyselina linolová. AcylCer jsou nejdelší Cer, které se v kůži vyskytují a pro její funkci jsou zcela nezbytné. Jejich úplný deficit není slučitelný se životem, protože dochází k obrovským ztrátám vody přes kůži. Zdravá kožní bariéra obsahuje přibližně 9% acylCer z celkového množství Cer. Výkyvy v hladině acylCer (většinou snížené množství) byly nalezeny u několika závažných kožních onemocnění, jako je atopická dermatitida, psoriáza nebo lamelární ichthyóza. Jelikož acylCer nejsou komerčně dostupné, bylo potřeba vyvinout a optimalizovat jejich totální syntézu. Výchozí látkou pro přípravu acylCer se stala 16-bromhexadekanová kyselina. Z této kyseliny byla připravena jak fosfoniová sůl, tak aldehyd, dva reaktanty pro Wittigovu reakci, což je klíčový krok v této syntéze, který umožnil přípravu ultra-dlouhého řetězce. Vzniklá 32C nenasycená kyselina byla posléze převedena na sukcinimidylester, který zvýšil její rozpustnost a zároveň posloužil jako chránící skupina při acylaci kyselinou linolovou. Navázání kyseliny linolové se podařilo s využitím Yamaguchiho esterifikační reakce. V posledním kroku reagoval sukcinimidylester kyseliny se sfingoidní bází za vzniku požadovaných acylCer. V konečném výsledku byla vyvinuta 12 kroková reakce s celkovým výtěžkem 11 % (pro množství v řádech desítek miligramů), případně 7 % (pro gramová množství). Dále byly syntetizovány Cer-1-fosfáty a modifikované gangliosidy. Cer-1-fosfáty byly připraveny mezifázovou fosforylací pomocí P(OCH3)3, následovanou hydrolýzou methylových skupin za vzniku dvou Cer-1-fosfátů založených na sfingosinu a dihydrosfingosinu s celkovým výtěžkem 34 % a 45 %. Tyto látky budou dále využity pro studium jejich úlohy v buněčné signalizaci při tvorbě kožní bariéry a jejich chování v lipidových membránách. Jako standard pro kvantifikaci gangliosidů v biologickém materiálu byl připraven modifikovaný gangliosid GM1 se zkráceným acylovým řetězcem. Jako výchozí látka byl použit přírodní gangliosid GM1, který byl enzymaticky deacylován a následně opět acylován kyselinou s kratším řetězcem v celkovém výtěžku 40 %. Připravené acylCer byly využity pro přípravu modelových lipidových membrán napodobujících kožní bariéru. Byly připraveny dvě série membrán – jednoduchý a složitý model. Jednoduchý model se skládal z jednoho acylCer (Cer EOS)/jednoho Cer (Cer NS)/lignocerové kyseliny/cholesterolu s přídavkem cholesteryl-sulfátu. Pomocí práškové rentgenové difrakce byla zkoumána potřebná koncentrace Cer EOS, při které je v modelových membránách pozorovatelná dlouhá periodická fáze (nezbytná pro správnou bariérovou funkci kůže). Bylo zjištěno, že tato fáze se objevuje od koncentrace 10 % Cer EOS a koexistuje s krátkou periodickou fází. Při 30 % Cer EOS se krátká fáze vytrácí. Při permeabilitních experimentech se však ukázalo, že tento model je příliš jednoduchý a že přídavek acylCer do membrány způsobuje zvýšení permeability pro modelové látky. Abychom získali výsledky relevantní k poznatkům in vivo, byl jednoduchý model nahrazen složitějším modelem, který obsahoval kromě rozdílných acylCer (případně jejich směsi) také směs Cer, směs mastných kyselin, cholesterol a přídavek cholesteryl-sulfátu. Studium složitějšího modelu bylo zaměřeno na porovnání rozdílné struktury acylCer hlavy. Permeabilita všech membrán složitého modelu s obsahem acylCer byla snížena oproti kontrole (bez acylCer), což mnohem lépe koreluje s experimenty na lidské kůži. Avšak měření práškové rentgenové difrakce ukázalo, že v tomto složitém modelu dlouhou lamelární fázi tvoří pouze nejsložitější membrána s obsahem směsi acylCer. Tyto výsledky poprvé popisují vztahy mezi strukturou acylCer a jejich chováním v lipidových membránách. Tento model bude v budoucnu využit k přípravě modelů lipidové bariéry u kožních onemocnění a ke studiu látek s potenciální schopností regenerovat poškození kožní bariéry. Připravené acylCer byly také použity jako standardy pro kvantifikaci acylCer v biologickém materiálu. S použitím HPTLC se nám podařilo dokázat, že námi připravené acylCer se skutečně vyskytují v kůži a také se podařilo vylepšit jejich kvantitativní analýzu a dokázat, že pro kvantifikaci jsou nezbytné správné standardy, jinak dochází k chybě v řádech až stovek procent. AcylCer byly také použity při kvantifikaci lipidů v rekonstruované kůži se sníženou expresí filaggrinu jako modelu atopické dermatitidy, kde bylo zjištěno, že agonisté α-podtypu receptoru aktivovaného peroxizomovými proliferátory zlepšují homeostázu v kůži, zvyšují bariérovou funkci kůže a normalizují složení volných mastných kyselin. Závěrem lze říci, že byla vyvinuta účinná a spolehlivá syntéza lidských ultra-dlouhých Cer, proveditelná i ve větším měřítku. Tyto připravené acylCer byly využity pro tvorbu modelových lipidových membrán simulujících zdravou, případně porušenou kožní bariéru, což otevírá nové možnosti in vitro hodnocení potenciálních léčiv pro závažná kožní onemocnění, jako je atopická dermatitida či psoriáza. Tyto acylCer byly rovněž využity ke zlepšení kvantitativní analýzy lipidů v kožních vzorcích.
Abstract v angličtině:
Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Inorganic and Organic chemistry Candidate: Mgr. Lukáš Opálka Supervisor: doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. Title of doctoral thesis: Synthesis of human ω-O-acylceramides and evaluation of their effects on barrier properties of skin lipid membranes The main objective of this work was to synthesize and study human acylceramides (acylCer, ceramides of the EO type) with the focus on the relationships between the acylCer concentration , structure of their polar head, their ability to form lamellar phases and permeability of model lipid membranes. Another objective was to synthesize ceramide-1-phosphates for the study of their signaling role in skin barrier and an analogue of ganglioside GM1 with shorter acyl chain as a standard for analysis of these lipids. Ceramides (Cer) belong to the family of sphingolipids. They are the central molecules in sphingolipid metabolism, they participate on cell regulatory processes and the formation of human skin lipid barrier. The main skin barrier is situated in the stratum corneum (SC), which is the uppermost layer of skin. The purpose of SC is to maintain homeostasis of the inner environment and to prevent the penetration of exogenous substances, allergens and bacteria to the organism. AcylCer are composed of sphingoid base, which is acylated by ultra-long (≥ 30C) acid, esterified by linoleic acid at its ω-hydroxyl group. AcylCer are the longest Cer occurring in the skin and they are essential for the proper function of the skin. Their complete deficit is lethal due to immense water loss through the skin. Healthy skin barrier contains approximately 9% of acylCer (of all Cer). Disturbances in the acylCer levels (mostly decreased levels) were found in several severe skin diseases, such as atopic dermatitis, psoriasis of lamellar ichthyosis. Due to commercial unavailability of acylCer, we needed to develop and optimize their complete synthesis. The starting compound for this synthesis was 16-bromohexadecanoic acid. This acid served as a precursor for the preparation both the phosphonium salt and aldehyde, two reactants for Wittig reaction, which was a key step in this synthesis that enabled the preparation of the ultra-long chain. Resulting 32C unsaturated acid was converted to succinimidyl ester, which increased its solubility and simultaneously served as a protecting group during its acylation with linoleic acid. Linoleic acid was attached to the ultra-long hydroxyl acid using Yamaguchi esterification reaction. In the last step, succinimidyl ester of the acid reacted with sphingoid base resulting in the desired acylCer. 12-step synthesis with overall 11% yield (in tens of milligrams), and 7% (in gram amounts) was developed. Next, Cer-1-phosphates and modified gangliosides were synthesized. Cer-1-phosphates were synthesized using interphase phosphorylation with P(OCH3)3, followed by the hydrolysis of methyl groups to obtain two Cer-1-phosphates based on sphingosine and dihydrosphingosine in the overall yields 34% and 45%. These compounds will be used for the study of their role in cell signalization during the formation of skin barrier and their behavior in lipid membranes. Ganglioside GM1 with shorter acyl chain was prepared as a standard for ganglioside quantification. Natural ganglioside GM1 was used as a starting compound. It was enzymatically deacylated and then acylated again with an acid with shorter chain to obtain the product in 40% overall yield. The prepared acylCer were used for the preparation of model lipid membranes mimicking the skin lipid barrier. Two series of the membranes were prepared – a simple and complex model. The simple model was composed of one acylCer (Cer EOS)/one Cer (Cer NS)/ lignoceric acid/cholesterol with addition of cholesteryl sulfate. Using X-ray powder diffraction we studied the concentration of Cer EOS necessary for the formation of the long periodicity phase (essential for the proper barrier function of the skin). It was found, that this phase appears at 10% concentration of Cer EOS and coexists with the short periodicity phase. At 30% Cer EOS, the short periodicity phase disappeared. Though in permeability experiments, this model showed to be too simple and the addition of acylCer to the membrane led to increase in the permeability to model compounds. To obtain results relevant to in vivo findings, the simple model was substituted by more complex model that contained different acylCer (or their mixture), mixture of Cer, mixture of fatty acids, cholesterol and an addition of cholesteryl sulfate. Experiments with complex model were focused on the comparison of different structures of acylCer polar head. The permeability of all membranes of the complex model containing acylCer was decreased compared to control (without acylCer), which correlates much better with the experiments using human skin. However, X-ray powder diffraction measurements showed that only the most complex membrane with the mixture of acylCer forms the long periodicity phase. These results for the first time describe the relationships between the acylCer structure and their behavior in lipid membranes. In the future, this model will be used in preparation of the models of lipid barrier in skin diseases and to study compounds with potential ability to regenerate impaired skin barrier. The prepared acylCer were also used as standards for the quantification of acylCer in biological material. Using HPTLC, we were able to prove that the prepared acylCer occur in skin. We also improved their quantitative analysis and found that identical standards are necessary for their proper quantification. Using incorrect standards may lead to errors reaching up to hundreds percent. AcylCer were also used for quantification of lipids in reconstructed skin with filaggrin knockdown as a model of atopic dermatitis. It was found that peroxisome proliferator activated receptor α agonists improve skin homeostasis, increase skin barrier function and normalize the composition of free fatty acids. To conclude, an efficient, scalable and reliable synthesis of human ultra-long Cer was developed. The synthesized acylCer were used for the preparation of model lipid membranes simulating healthy or impaired skin, which opens new possibilities of in vitro evaluation of potential drugs for the treatment of severe skin diseases, such as atopic dermatitis or psoriasis. These acylCer were also used to improve quantitative analysis of lipids in skin samples.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lukáš Opálka 4.39 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Lukáš Opálka 4.67 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lukáš Opálka 301 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lukáš Opálka 437 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc. PharmDr. Kateřina Vávrová, Ph.D. 203 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Ing. František Hampl, CSc. 184 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Norbert Kučerka, Ph.D. 226 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Milan Pour, Ph.D. 287 kB