velikost textu

Development of ultrastructural methods and their application in studies on the cell nucleus

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Development of ultrastructural methods and their application in studies on the cell nucleus
Název v češtině:
Vývoj ultrastrukturálních metod a jejich použití pro studium buěčnénho jádra
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Anatoly Filimonenko, Ph.D.
Školitel:
prof. RNDr. Pavel Hozák, DrSc.
Oponenti:
Ing. Jana Nebesářová, CSc.
Dr. Christian Lanctôt, Ph.D.
Id práce:
116541
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová a buněčná biologie (P1529)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
26. 6. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
buněčné jádro, DNA, replikace, elektronová mikroskopie, cytochemie
Klíčová slova v angličtině:
cell nucleus, DNA, replication, electron microscopy, cytochemistry
Abstrakt:
SOUHRN Navzdory možnostem, které přinášejí molekulárně-biologické metody při odhalování souhry různých biologických molekul a molekulárních komplexů, pochopení jednotlivých funkcí v živých buňkách vyžaduje použití in situ metod. Je zřejmé, že tyto metody by měly zajistit maximální rozlišení a nejlepší možné zachování biologického objektu v přirozeném stavu, stejně jako správné statistické vyhodnocení prostorových charakteristik lokalizace detekovaných molekulárních komplexů. Transmisní elektronová mikroskopie poskytuje nejlepší možné rozlišení pro analýzu biologických vzorků. Současná detekce více biologických molekul metodou nepřímého imunoznačení je zdrojem cenných informací o jejich lokalizaci v buněčných kompartmentech a jejich potenciálních interakcí v makromolekulárních komplexech. Vyvinuli jsme komplexní stereologickou metodu pro statistické hodnocení klastrování a kolokalizace značených antigenů na ultratenkých řezech, včetně uživatelsky přívětivého softwarového rozhraní. Dále jsme charakterizovali funkční mikroarchitekturu replikačních a transkripčních domén pomocí vyvinutých algoritmů. Výsledky ukazují, že DNA replikace je v buněčném jádře kompartmentalizována na úrovni DNA ohnisek a nasvědčují modelu, ve kterém centra syntézy DNA jsou zakotvena a chromatinové smyčky se pohybují. V HeLa buňkách jsme ultrastrukturálně popsali dva odlišné morfologické typy replikačních míst – replikační tělíska a replikační ohniska. Oba druhy replikačních míst obsahují seskupení enzymů, strukturních a regulačních proteinů se známou účastí v samotném procesu replikace nebo v regulaci průběhu S-fáze buněčného cyklu. Nicméně, některé regulační a strukturní proteiny byly detekovány pouze v replikačních tělískách nebo replikačních ohniskách. V transkripčních místech jsme ultrastrukturálně popsali přítomnost dvou hlavních molekulárních motorů v buňce. Na modelu stimulovaných lidských lymfocytů jsme ukázali, že přítomnost aktinu v buněčných kompartmentech byla většinou nezávislá na úrovni fyziologické aktivace buňky, zatímco lokalizace jaderného myosinu I vykazovala dynamické změny během aktivace transkripce. Pro rozšíření technických možností analýzy mnohočetných interakcí molekul na ultrastrukturální úrovni jsme vyvinuli nový systém umožňující současné imunoznačení až pěti antigenů oproti stávající možnosti označení pouze dvou. Detekce se provádí za použití nových kovových nanočástic rozdílného tvaru snadno rozlišitelných v transmisním elektronovém mikroskopu. Nanočástice se stříbrným středem a zlatým povrchem, zlaté tyčinkovité nanočástice a kubické paládiové nanočástice byly syntetizovány, konjugovány s protilátkami a použity k současné detekci PIP2, B23, aktinu, Sm proteinu, a SMC2 na ultratenkých řezech HeLa buněk. Ukázali jsme, že ohniska značená PIP2 se nachází v těsném kontaktu s oblastmi značení Sm proteinu, aktinu, a/nebo SMC2 a tvoří komplementární 3D domény v buněčném jádře. Optimální zachování struktury biologického vzorku a zároveň jeho antigenních vlastností není jednoduchým úkolem. Ukázali jsme, že akrylová pryskyřice LR White je vhodná pro zalití chemicky fixovaných vzorků a vzorků po mrazové fixaci. Nicméně některé antigeny mohou být lépe zachovány po zalití do Lowicrylu HM 20. Přidání 1.5% vody a 0.5% glutaraldehydu do acetonu během mrazové substituce ve většině případů zlepšuje zachování antigenů při dobře zachované ultrastruktuře, jak ukazují výsledky značení imunozlatem a biochemického měření množství proteinu.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Despite the capabilities of molecular-biological methods in deciphering the interplay of different biological molecules and molecular complexes, the understanding of respective functions in living cells requires application of in situ methods. Obviously, these methods should provide maximal resolution and the best possible preservation of the biological object in a native state, as well as correct statistical evaluation of the spatial characteristics of detected molecular players. Transmission electron microscopy provides the highest possible resolution for analysis of biological samples. The simultaneous detection of biological molecules by means of indirect immunolabeling provides valuable information about their localization in cellular compartments and their possible interactions in macromolecular complexes. To analyze this, we have developed a complex stereological method for statistical evaluation of immunogold clustering and colocalization patterns of antigens on ultrathin sections, including a user-friendly interface. Functional microarchitecture of DNA replication and transcription sites has been successfully characterized using the developed stereological tools. Our data demonstrate that DNA replication is compartmentalized within cell nuclei at the level of DNA foci and support the view that the synthetic centers are spatially constrained while the chromatin loops are dynamic during DNA synthesis. In HeLa cells, we have ultrastructurally distinguished two morphological types of replication sites - replication bodies and replication foci. Both types contain a set of enzymatic, structural and regulatory proteins, which are known to take part in replication itself or in S-phase regulation. Some regulatory and structural proteins, however, were found only in replication sites of one type. In transcription sites, we have demonstrated on the ultrastructural level the presence of two main cellular molecular motor molecules. Using the model of PHA-stimulated human lymphocytes, the presence of actin was mainly not dependent on the activity status of the cells, while nuclear myosin I shows dynamic behavior upon transcriptional activation. To extend the technical capabilities for analysis of multiple interactions at the ultrastructural level, we have developed a new system, which allowed us simultaneous immunolabeling of up to five antigens, as compared to only two conventionally available. Gold-silver core-shell nanoparticles, gold nanorods and cubic palladium nanoparticles distinguishable in TEM by their shape were synthesized, and PIP2, B23, actin, Sm protein, and SMC2 were simultaneously detected on ultrathin sections. We have demonstrated that PIP2-positive foci were found in a close contact with Sm–, actin-, and/or SMC2-rich foci, forming complementary 3D domains in the cell nucleus. Simultaneous ultrastructure and antigen preservation of biological samples is not a trivial task. LR White resin is suitable for sample embedding after both chemical and cryo fixation. However, for some antigens Lowicryl HM 20 could be preferable. Addition of 1.5% water and 0.5% glutaraldehyde into the acetone for freeze substitution improves the antigen preservation in most cases, as shown by immunogold labeling and biochemical quantification of protein amount, while the ultrastructure stays well preserved.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Anatoly Filimonenko, Ph.D. 9.55 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Anatoly Filimonenko, Ph.D. 70 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Anatoly Filimonenko, Ph.D. 144 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Anatoly Filimonenko, Ph.D. 1.32 MB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jana Nebesářová, CSc. 59 kB
Stáhnout Posudek oponenta Dr. Christian Lanctôt, Ph.D. 225 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 498 kB