text size

Understanding the interaction of antibodies and transcription factors with their ligands through structural biology

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Understanding the interaction of antibodies and transcription factors with their ligands through structural biology
Title (in czech):
Využití strukturní biologie ke studiu interakce protilátek a transkripčních faktorů s jejich ligandy
Type:
Dissertation
Author:
Mgr. Jana Písačková
Supervisor:
RNDr. Pavlína Maloy Řezáčová, Ph.D.
Opponents:
doc. Ing. Richard Hrabal, CSc.
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Thesis Id:
116256
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Biochemistry (31-250)
Study programm:
Biochemistry (P1406)
Study branch:
-
Degree granted:
Ph.D.
Defence date:
29/06/2015
Defence result:
Pass
Language:
English
Keywords (in czech):
CD44, DeoR, mapování epitopu, MEM-85, NMR, prokaryotní transkripční faktor, protilátkové fragmenty, rentgenová krystalografie, SAXS, scFv
Keywords:
antibody fragments, CD44, DeoR, epitope mapping, MEM-85, NMR, prokaryotic trancription factor, SAXS, scFv, X-ray crystallography
Abstract (in czech):
Abstrakt K pochopení funkce proteinu významně přispívá znalost jeho trojrozměrné struktury, obzvláště v případě komplexů s ligandy. Metody strukturní biologie, jako je rentgenová krystalografie, SAXS nebo NMR, jsou proto ve strukturní analyse interakcí proteinů s ligandy široce využívány. V této práci byly tyto metody využity k objasnění molekulární podstaty dvou biologických dějů využívajících proteinové interakce: rentgenostrukturní analysa byla použita ke studiu vazby efektorové molekuly k prokaryotnímu transkripčnímu faktoru, metody NMR a SAXS byly využity ke studiu interakce monoklonální protilátky s proteinovým antigenem. Transkripční regulátor DeoR negativně reguluje expresi katabolických genů pro utilizaci deoxyribonukleosidů a deoxyribosy v bakterii Bacillus subtilis. DeoR se skládá z N-koncové DNA-vazebné domény a z C-koncové efektor-vazebné domény (C-DeoR). Jeho funkce je regulována vazbou nízkomolekulárního efektoru deoxyribosa-5-fosfátu. Vyřešili jsme krystalové struktury C-DeoR ve volné formě a v komplexu s deoxyribosa-5-fosfátem. Strukturní analysa odhalila unikátní vazbu mezi molekulou efektoru a lysylovým zbytkem efektor-vazebného místa prostřednictvím reversibilní dvojné vazby typu Schiffovy base. Fysiologická relevance této vazby byla potvrzena mutačními experimenty a také analysou tvorby kovalentních aduktů v roztoku pomocí hmotnostní spektrometrie. Porovnání struktur volné C-DeoR a komplexu C-DeoR s efektorem vysvětlilo na molekulární úrovni funkci DeoR jako molekulárního spínače. CD44, buněčný receptor pro hyaluronát, se účastní buněčné adhese, migrace a metastazování nádorů. CD44 váže hyaluronát prostřednictvím hyaluronát-vazebné domény (HABD), což indukuje v HABD rozsáhlou konformační změnu, vedoucí k proteolytickému uvolnění CD44 z povrchu buněk. Vytvořili jsme jednořetězcový variabilní fragment (scFv) protilátky MEM-85. MEM-85 má terapeutický potenciál, rozpoznává nedostatečně popsaný epitop v HABD, blokuje vazbu hyaluronátu a indukuje odštěpení CD44. Fragmenty scFv jsou kvůli své oligomeraci obvykle nehomogenní. Vyvinuli jsme nový optimalizační přístup, pomocí něhož jsme připravili homogenní vzorek scFv vhodný pro NMR mapování antigen-vazebného epitopu protilátky MEM-85 v CD44 HABD. Toto mapování společně s mutační analysou vedlo k identifikaci protilátkového epitopu v C-koncové části HABD. Na základě SAXS analysy jsme také vytvořili model komplexu HABD s scFv MEM-85. Tyto biofysikální metody přinesly detailní vhled do mechanismu funkce MEM-85: MEM-85 váže epitop, který se nachází mimo hyaluronát-vazebné místo, a indukuje v C-konci HABD strukturní změny, jež jsou podobné změnám vyvolaným vazbou hyaluronátu. Blokace vazby hyaluronátu protilátkou MEM-85 proto nespočívá ve fysické kompetici o vazebné místo, ale jde spíše o allosterický přenosový efekt.
Abstract:
Abstract Understanding protein function highly benefits from the knowledge of its three-dimensional structure, especially in the case of protein-ligand complexes. Structural biology methods such as X-ray crystallography, SAXS and NMR are therefore widely used for structural studies of protein-ligand interaction. In this work, these methods were used to understand two biological processes involving protein interactions: X-ray structural analysis was used to study binding of effector molecule to a prokaryotic transcription factor. NMR and SAXS techniques were used to study interaction of a monoclonal antibody with its protein antigen. Transcriptional regulator DeoR negatively regulates the expression of catabolic genes for the utilization of deoxyribonucleosides and deoxyribose in Bacillus subtilis. DeoR comprises an N-terminal DNA-binding domain and a C-terminal effector-binding domain (C-DeoR), and its function is regulated by binding of a small-molecular effector deoxyribose-5-phosphate. We determined crystal structures of C-DeoR both in the free form and in complex with deoxyribose-5-phosphate. Structural analysis revealed unique covalent binding of effector molecule through a reversible Schiff-base double bond with an effector-binding-site lysine residue. The physiological nature of this binding mode was confirmed by mutational analysis and mass spectrometry of the Schiff-base adducts formed in solution. Comparison of the free and effector-bound structures of C-DeoR explained on a molecular level the mechanism of DeoR function as a molecular switch. CD44, the cell receptor for hyaluronate, is involved in cell adhesion, migration, and tumor metastasis. CD44 binds hyaluronate through the hyaluronate-binding domain (HABD), which triggers an extensive conformational rearrangement in HABD that induces CD44 shedding. We constructed a single-chain variable fragment (scFv) of antibody MEM-85. MEM-85 is of therapeutic interest, recognizes a poorly characterized epitope in HABD, blocks hyaluronate binding, and induces CD44 shedding. Antibody scFv fragments exhibit poor homogeneity caused by scFv oligomerization. We developed a novel optimization approach, which we used for the preparation of a homogeneous scFv sample for NMR-based mapping of the epitope of MEM-85 in HABD. This mapping together with mutational analysis identified epitope residues in the C-terminal tail of the HABD. Additionally, we built a rigid-body model of the HABD – scFv MEM-85 complex based on the SAXS data. These biophysical methods provided a detailed insight into the mechanism of MEM-85 action: MEM-85 binds to an epitope located outside the hyaluronate-binding site and induces a conformational change in the HABD tail, similar to that induced by hyaluronate. The mechanism of MEM-85 cross-blocking of hyaluronate binding is not a direct physical competition, but rather an allosteric, relay-like effect.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Jana Písačková 25.1 MB
Download Abstract in czech Mgr. Jana Písačková 69 kB
Download Abstract in english Mgr. Jana Písačková 68 kB
Download Autoreferat / doctoral thesis summary Mgr. Jana Písačková 8.01 MB
Download Opponent's review doc. Ing. Richard Hrabal, CSc. 212 kB
Download Opponent's review doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. 150 kB
Download Defence's report 1.03 MB