velikost textu

Understanding the interaction of antibodies and transcription factors with their ligands through structural biology

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Understanding the interaction of antibodies and transcription factors with their ligands through structural biology
Název v češtině:
Využití strukturní biologie ke studiu interakce protilátek a transkripčních faktorů s jejich ligandy
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Jana Písačková
Školitel:
RNDr. Pavlína Maloy Řezáčová, Ph.D.
Oponenti:
doc. Ing. Richard Hrabal, CSc.
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Id práce:
116256
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
29. 6. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
CD44, DeoR, mapování epitopu, MEM-85, NMR, prokaryotní transkripční faktor, protilátkové fragmenty, rentgenová krystalografie, SAXS, scFv
Klíčová slova v angličtině:
antibody fragments, CD44, DeoR, epitope mapping, MEM-85, NMR, prokaryotic trancription factor, SAXS, scFv, X-ray crystallography
Abstrakt:
Abstrakt K pochopení funkce proteinu významně přispívá znalost jeho trojrozměrné struktury, obzvláště v případě komplexů s ligandy. Metody strukturní biologie, jako je rentgenová krystalografie, SAXS nebo NMR, jsou proto ve strukturní analyse interakcí proteinů s ligandy široce využívány. V této práci byly tyto metody využity k objasnění molekulární podstaty dvou biologických dějů využívajících proteinové interakce: rentgenostrukturní analysa byla použita ke studiu vazby efektorové molekuly k prokaryotnímu transkripčnímu faktoru, metody NMR a SAXS byly využity ke studiu interakce monoklonální protilátky s proteinovým antigenem. Transkripční regulátor DeoR negativně reguluje expresi katabolických genů pro utilizaci deoxyribonukleosidů a deoxyribosy v bakterii Bacillus subtilis. DeoR se skládá z N-koncové DNA-vazebné domény a z C-koncové efektor-vazebné domény (C-DeoR). Jeho funkce je regulována vazbou nízkomolekulárního efektoru deoxyribosa-5-fosfátu. Vyřešili jsme krystalové struktury C-DeoR ve volné formě a v komplexu s deoxyribosa-5-fosfátem. Strukturní analysa odhalila unikátní vazbu mezi molekulou efektoru a lysylovým zbytkem efektor-vazebného místa prostřednictvím reversibilní dvojné vazby typu Schiffovy base. Fysiologická relevance této vazby byla potvrzena mutačními experimenty a také analysou tvorby kovalentních aduktů v roztoku pomocí hmotnostní spektrometrie. Porovnání struktur volné C-DeoR a komplexu C-DeoR s efektorem vysvětlilo na molekulární úrovni funkci DeoR jako molekulárního spínače. CD44, buněčný receptor pro hyaluronát, se účastní buněčné adhese, migrace a metastazování nádorů. CD44 váže hyaluronát prostřednictvím hyaluronát-vazebné domény (HABD), což indukuje v HABD rozsáhlou konformační změnu, vedoucí k proteolytickému uvolnění CD44 z povrchu buněk. Vytvořili jsme jednořetězcový variabilní fragment (scFv) protilátky MEM-85. MEM-85 má terapeutický potenciál, rozpoznává nedostatečně popsaný epitop v HABD, blokuje vazbu hyaluronátu a indukuje odštěpení CD44. Fragmenty scFv jsou kvůli své oligomeraci obvykle nehomogenní. Vyvinuli jsme nový optimalizační přístup, pomocí něhož jsme připravili homogenní vzorek scFv vhodný pro NMR mapování antigen-vazebného epitopu protilátky MEM-85 v CD44 HABD. Toto mapování společně s mutační analysou vedlo k identifikaci protilátkového epitopu v C-koncové části HABD. Na základě SAXS analysy jsme také vytvořili model komplexu HABD s scFv MEM-85. Tyto biofysikální metody přinesly detailní vhled do mechanismu funkce MEM-85: MEM-85 váže epitop, který se nachází mimo hyaluronát-vazebné místo, a indukuje v C-konci HABD strukturní změny, jež jsou podobné změnám vyvolaným vazbou hyaluronátu. Blokace vazby hyaluronátu protilátkou MEM-85 proto nespočívá ve fysické kompetici o vazebné místo, ale jde spíše o allosterický přenosový efekt.
Abstract v angličtině:
Abstract Understanding protein function highly benefits from the knowledge of its three-dimensional structure, especially in the case of protein-ligand complexes. Structural biology methods such as X-ray crystallography, SAXS and NMR are therefore widely used for structural studies of protein-ligand interaction. In this work, these methods were used to understand two biological processes involving protein interactions: X-ray structural analysis was used to study binding of effector molecule to a prokaryotic transcription factor. NMR and SAXS techniques were used to study interaction of a monoclonal antibody with its protein antigen. Transcriptional regulator DeoR negatively regulates the expression of catabolic genes for the utilization of deoxyribonucleosides and deoxyribose in Bacillus subtilis. DeoR comprises an N-terminal DNA-binding domain and a C-terminal effector-binding domain (C-DeoR), and its function is regulated by binding of a small-molecular effector deoxyribose-5-phosphate. We determined crystal structures of C-DeoR both in the free form and in complex with deoxyribose-5-phosphate. Structural analysis revealed unique covalent binding of effector molecule through a reversible Schiff-base double bond with an effector-binding-site lysine residue. The physiological nature of this binding mode was confirmed by mutational analysis and mass spectrometry of the Schiff-base adducts formed in solution. Comparison of the free and effector-bound structures of C-DeoR explained on a molecular level the mechanism of DeoR function as a molecular switch. CD44, the cell receptor for hyaluronate, is involved in cell adhesion, migration, and tumor metastasis. CD44 binds hyaluronate through the hyaluronate-binding domain (HABD), which triggers an extensive conformational rearrangement in HABD that induces CD44 shedding. We constructed a single-chain variable fragment (scFv) of antibody MEM-85. MEM-85 is of therapeutic interest, recognizes a poorly characterized epitope in HABD, blocks hyaluronate binding, and induces CD44 shedding. Antibody scFv fragments exhibit poor homogeneity caused by scFv oligomerization. We developed a novel optimization approach, which we used for the preparation of a homogeneous scFv sample for NMR-based mapping of the epitope of MEM-85 in HABD. This mapping together with mutational analysis identified epitope residues in the C-terminal tail of the HABD. Additionally, we built a rigid-body model of the HABD – scFv MEM-85 complex based on the SAXS data. These biophysical methods provided a detailed insight into the mechanism of MEM-85 action: MEM-85 binds to an epitope located outside the hyaluronate-binding site and induces a conformational change in the HABD tail, similar to that induced by hyaluronate. The mechanism of MEM-85 cross-blocking of hyaluronate binding is not a direct physical competition, but rather an allosteric, relay-like effect.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jana Písačková 25.1 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jana Písačková 69 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jana Písačková 68 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Jana Písačková 8.01 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Ing. Richard Hrabal, CSc. 212 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. 150 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1.03 MB