text size

Biotechnologické využití rostlinných virů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Biotechnologické využití rostlinných virů
Titile (in english):
Plant virus-based biotechnology
Type:
Dissertation
Author:
Mgr. Petr Vaculík
Supervisor:
doc. RNDr. Noemi Čeřovská, CSc.
Opponents:
prof. Ing. Pavel Ryšánek, CSc.
doc. RNDr. Karel Petrzik, CSc.
Thesis Id:
115256
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Biochemistry (31-250)
Study programm:
Biochemistry (P1406)
Study branch:
-
Degree granted:
Ph.D.
Defence date:
09/09/2015
Defence result:
Pass
Language:
Czech
Keywords (in czech):
X virus bramboru, lidský papilomavirus, E7 onkoprotein, rostlinná transientní exprese, kometová analýza, bakteriální exprese
Keywords:
Potato virus X, human papillomavirus, E7 oncoprotein, plant transient expression, comet assay, bacterial expression
Abstract (in czech):
Abstrakt Model terciární struktury kapsidového proteinu X viru bramboru (PVX CP) byl využit jako předloha pro navržení nových pozic pro vkládání antigenů za účelem jejich prezentace na povrchu částic PVX. Na základě tohoto modelu bylo vybráno sedm pozic (A-G), které se nacházejí na povrchu virionu. Jako antigen pro prezentaci byl použit 17 aminokyselinový epitop onkoproteinu E7 odvozený od lidského papilomaviru typu 16 (E7 epitop) ve fúzi s 6xHis kotvou nebo StrepII kotvou, a to v obou možných uspořádáních (6xHis-E7, E7-6xHis, StrepII-E7 a E7-StrepII). Modifikované PVX CP byly nejprve exprimovány v Escherichia coli MC1061, kde docházelo k tvorbě virových částic pouze v případě vložení inzertů StrepII-E7 a E7-StrepII do pozice A v PVX CP. Výsledky z transientní exprese modifikovaných PVX CP v Nicotiana benthamiana prokázaly, že nejvhodnější pozice pro prezentaci antigenů je pozice A, která je situovaná mezi 24. a 25. aminokyselinou v PVX CP. Dále bylo zjištěno, že virové částice mohly být detekovány pouze v přítomnosti StrepII kotvy a že stabilita těchto částic je ovlivněna uspořádáním inzertu (StrepII-E7 vs. E7-StrepII), neboť bylo možné purifikovat pouze virové částice nesoucí inzert v uspořádání E7-StrepII. Kromě využití PVX pro přípravu antigen prezentujícího systému byl také posouzen vliv infekce PVX na integritu DNA Nicotiana tabacum cv. Xanthi metodou kometové analýzy, která prokázala, že k poškození rostlinné DNA při infekci PVX dochází, a že stupeň tohoto poškození odpovídá množství PVX.
Abstract:
Abstract The latest model of tertiary structure of capsid protein of potato virus X (PVX CP) was used as a template to design new insertion sites suitable for the preparation of PVX-based antigen presentation system. Based on this model, seven insertion sites (A-G) located in putative surface loops were tested. As an antigen inserted into these sites was used 17 amino acids long epitope derived from human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein (E7 epitope) fused with either 6xHis tag or StrepII tag in both possible orientations (6xHis-E7 and E7-6xHis, StrepII-E7 and E7-StrepII). Prior to plant expression, modified PVX CPs were expressed in Escherichia coli MC1061. The results showed that only PVX CP carrying StrepII-E7 or E7-StrepII in the insertion site A formed virus particles. The results from transient expression experiments with modified PVX CPs in Nicotiana benthamiana showed that only the insertion site A (located between 24th and 25th amino acid in the PVX CP) could tolerate all tested inserts. Importantly, viral particles were detected only in the presence of StrepII tag and their stability was affected by the insert orientation (StrepII-E7 vs. E7-StrepII) as only the viral particles presenting E7-StrepII could be purified. Besides the preparation of PVX-based antigen presentation system, an evaluation of DNA damaging potential of PVX on Nicotiana tabacum var. Xanthi by the comet assay was performed. Based on this assay, it was shown that PVX caused DNA damage and the extent of DNA damage correlated with amount of PVX.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Petr Vaculík 4.18 MB
Download Abstract in czech Mgr. Petr Vaculík 284 kB
Download Abstract in english Mgr. Petr Vaculík 277 kB
Download Autoreferat / doctoral thesis summary Mgr. Petr Vaculík 968 kB
Download Opponent's review prof. Ing. Pavel Ryšánek, CSc. 141 kB
Download Opponent's review doc. RNDr. Karel Petrzik, CSc. 285 kB
Download Defence's report 1.03 MB