velikost textu

Struktura a vlastnosti modifikovaných složek nukleových kyselin

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Struktura a vlastnosti modifikovaných složek nukleových kyselin
Název v angličtině:
The Structure and Properties of Modified Nucleic Acid Components
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Eliška Procházková
Školitel:
RNDr. Martin Dračínský, Ph.D.
Oponenti:
Prof. Ing. Antonín Lyčka, DrSc.
doc. Ing. Richard Hrabal, CSc.
Id práce:
115131
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Program studia:
Fyzikální chemie (P1404)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
7. 9. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRAKT Modifikované složky nukleových kyselin (nukleotidy, nukleosidy, nukleobáze) vykazují celou řadu biologických účinků, jako jsou antivirové, cytostatické, antimikrobiální nebo antioxidační. Spousta z nich je úspěšně využívána v klinické praxi, např. jako léky proti HIV nebo hepatitidě typu B. Prvním předpokladem pro studium biologických vlastností je správné určení chemické struktury a konformace studovaných látek. Pro tento účel se nejčastěji používá nukleární magnetická rezonanční (NMR) spektroskopie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií. NMR spektroskopií mohou být studovány také fyzikálně-chemické vlastnosti, např. konformační změny, tautomerní formy, protonační místa, acidobazické vlastnosti, nekovalentní interakce, izotopové výměny nebo interakce s biomolekulami. Podobně jako v roztocích lze použít NMR spektroskopii pro studium složek nukleových kyselin (NACs) i v pevné fázi. Tato metoda našla své uplatnění po velkém rozmachu výpočetní chemie během posledních desetiletí. Různé struktury v pevné fázi (polymorfní formy) nebo dynamiku těchto látek lze studovat NMR spektroskopií v pevné fázi v kombinaci s kvantově-chemickými výpočty. V této práci jsem se zabývala určením struktury a fyzikálně-chemických vlastností modifikovaných NACs pomocí NMR spektroskopie v kapalné, ale i v pevné fázi v kombinaci s DFT výpočty NMR parametrů. Pro stanovení struktury jsem použila 1D a 2D NMR experimenty, také jsem stanovila konfiguraci a konformaci studovaných látek. Během této strukturní analýzy byla u některých purinových derivátů zaznamenána možnost špatného přiřazení NMR signálů, proto byla vyvinuta nová metoda pro jejich spolehlivé přiřazení. Tato metoda je založena na porovnání naměřených a vypočtených heteronukleárních interakčních konstant. Stejný přístup založený na kombinaci experimentálních a vypočtených dat byl použit pro vývoj nové metody, která umožnila predikovat preferované tautomerní formy purinových derivátů v roztoku. Vodíková vazba, která je pro život nezbytná, může být studována NMR spektroskopií velmi podrobně. Studovali jsme nitrosopyrimidinové deriváty s pevnými vodíkovými vazbami, které stabilizují dva konformery, které se liší pouze orientací nitroso skupiny. Zkoumali jsme rovnovážné složení směsi rotamerů v závislosti na pyrimidinové substituci. Z teplotní závislosti byly stanoveny rotační bariéry nitroso skupiny. V některých případech bylo možné oba rotamery od sebe oddělit kolonovou chromatografií už při laboratorní teplotě. Čistota obou rotamerů byla potvrzena NMR spektroskopií v pevné fázi a X-ray analýzou. Z naměřené kinetiky interkonverze rotamerů byly stanoveny rotační bariéry kolem jednoduché C5-NO vazby. Experimentální hodnoty byly podpořeny DFT výpočty. Celá řada biologicky aktivních látek není schopna projít přes buněčnou membránu, proto se připravují lipofilnější deriváty (proléčiva). Jsou navrhovány tak, aby se v buňce působením vnitrobuněčných enzymů uvolnila aktivní látka. Studovali jsme, zda by nově připravený fosforamidátový derivát mohl fungovat jako proléčivo, zda bude štěpen karboxypeptidasou v předpokládané metabolické dráze. Tato enzymová degradace byla studována 31P NMR spektroskopií. Výchozí fosforamidát má na atomu fosforu chirální centrum, vzniknou dva diastereoisomery, které lze pozorovat jako dva signály v 31P NMR spektru. Po několika hodinách enzymové reakce byl pozorován pouze jeden signál, což znamená, že u konečného produktu zaniklo chirální centrum. Stejné produkty byly získány chemickou hydrolýzou výchozího fosforamidátu triethylaminem a navržená chemická struktura byla potvrzena 1H, 13C a 2D NMR experimenty. Struktura látek v pevné fázi ovlivňuje jejich biologické účinky a informace o jejich polymorfní struktuře je nezbytná pro patentní řízení. Pro zkoumání polymorfních krystalů byla v této práci použita 13C NMR spektra měřená v pevné fázi pod magickým úhlem (CP-MAS NMR). Připravila jsem modelové krystaly tří farmaceuticky a průmyslově využívaných látek a charakterizovala jsem je NMR spektroskopií v pevné fázi. Dále byla měřena Ramanova spektra a struktura polymorfních krystalů byla ověřena X-ray analýzou. Tato data byla doplněna DFT výpočty. Při studiu biologických účinků se studované látky obvykle rozpouští v DMSO, kde zůstávají někdy i dlouhou dobou. Pozorovali jsme barevné změny roztoků 5-aminopyrimidinových derivátů v DMSO. Sledovali jsme tyto přeměny NMR a UV/Vis spektroskopií a navržené struktury barevných produktů byly ověřeny sledem chemických reakcí.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Modified nucleic acid components (nucleotides, nucleosides, nucleobases) display a wide range of biological activities such as antiviral, cytostatic, antimicrobial or antioxidative. Many of them are successfully used in clinical practice, for instance as anti-HIV drugs or in hepatitis B treatment. The first precondition for understanding biological effects is to evaluate the chemical structure as well as the conformation of the studied compounds correctly. For this purpose, solution-state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in combination with mass spectrometry is the most frequently used method. Not only the structure, but also physico- chemical properties can be investigated using NMR spectroscopy, for instance, conformational changes, tautomeric forms, protonation sites, acido-basic properties, non-covalent interactions, isotopic exchanges or interactions with biomolecules. Similarly to solutions, NMR spectroscopy can be employed in studies of nucleic acid components (NACs) in solid state. This technique found assertion after computational-chemistry methods development during the last decades. Different solid-state structures (polymorphic forms) or dynamics of these compounds can be established by solid-state NMR spectroscopy in combination with quantum-chemical calculations. In this work, I dealt with the structure elucidation as well as the investigation of the physico- chemical properties of modified nucleotides, nucleosides and nucleobases using NMR spectroscopy both in solution state and solid state in combination with DFT calculations of NMR parameters. For the structure determination, 1D in combination with 2D NMR experiments were employed; the configuration and conformation of studied compounds were also investigated. During this analysis, it was noticed that NMR signals could be misassigned in substituted purine derivatives, so a new method for unambiguous NMR signal assignment in purines was developed. This method is based on the measurement of heteronuclear coupling constants in combination with DFT calculations. The same approach including correlations between experimental and calculated data was applied for development of new method for prediction of preferred tautomeric forms of purine derivatives in solution. A non-covalent interaction essential for life is hydrogen bond (H-bond), which can be studied by NMR spectroscopy in detail. We studied nitrosopyrimidine derivatives with strong intramolecular H-bonds which stabilized two conformers, differing only in nitroso group orientation. We investigated composition of the rotamers mixture in equilibrium depending on the pyrimidine substitution. From temperature-dependent 1H NMR spectra, the rotational barriers of the nitroso group were estimated. In some cases, it was possible to separate both rotamers from each other by column chromatography even at room temperature and their purity was confirmed by SS-NMR data as well as by X-ray analysis. Kinetics of the rotamer interconversion was measured to determine rotational barriers around C5-NO single bond. Experimental data were supported by DFT calculations. Many biologically active compounds are unable to pass across the cell membrane, therefore, more lipophilic derivatives (prodrugs) are often prepared; they are designed with the aim of active compound release after a reaction with intracellular enzymes. For confirmation that newly prepared phosphoramidate derivatives could work as prodrugs and they are decomposed by carboxypeptidase in the supposed metabolic pathway, we studied their enzymatic decomposition using 31P NMR spectroscopy. The monitoring of the reaction is based on the fact that the starting phosphoramidate has a chiral center at phosphorus atom, so it has two signals in proton decoupled 31P NMR spectra corresponding to two diastereoisomers. After several hours of the enzymatic reaction, a single 31P signal is observed, which indicates that the final product does not contain a chiral center at the phosphorus atom. The same products were obtained after non- enzymatic hydrolysis with triethylamine and the suggested chemical structure was confirmed using 1H, 13C and 2D NMR experiments. The solid-state structure of given compounds influences their biological effects and the information about their polymorphic structures is crucial for granting licenses obtained from regulatory authorities. For investigation of polymorphic crystals in this work, 13C cross-polarization magic-angle spinning (CP-MAS) NMR spectroscopy was used. We prepared model polymorphic crystal forms of three pharmaceutically or industrially important compounds and characterized them using CP-MAS NMR spectroscopy as well as by Raman spectroscopy and we confirmed the determined structures by X-ray analysis. These data were supplemented by DFT calculations. For biological properties investigation, studied compounds are usually dissolved in DMSO for a long time. We observed color changes of 5-aminopyrimidine derivatives dissolved in DMSO. We monitored these transformations by NMR and UV/Vis spectroscopy and we used series of chemical reactions with alloxan to confirm the structure of the colorful products.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Eliška Procházková 30.34 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Eliška Procházková 162 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Eliška Procházková 158 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Eliška Procházková 2.51 MB
Stáhnout Posudek oponenta Prof. Ing. Antonín Lyčka, DrSc. 142 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Ing. Richard Hrabal, CSc. 151 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 757 kB