velikost textu

Canonical and non-canonical signalling triggered by activated TRAIL receptors in human cells

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Canonical and non-canonical signalling triggered by activated TRAIL receptors in human cells
Název v češtině:
Kanonické a nekanonické signální dráhy aktivované receptory pro ligand TRAIL v lidských buňkách
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Zuzana Nahácka, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Ladislav Anděra, CSc.
Oponenti:
prof. PharmDr. Emil Rudolf, Ph.D.
RNDr. Jan Vondráček, Ph.D.
Id práce:
114984
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
15. 5. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
ligandy smrti, TRAIL, apoptóza, signalizace, nádorové kmenové buňky, mikroprostředí
Klíčová slova v angličtině:
Death ligands, TRAIL, apoptosis, signaling, cancer stem cells, microenvironment
Abstrakt:
ABSTRAKT TRAIL ligand spouští apoptózu interakcí se svými dvěma pro-apoptotickými receptory TRAIL- R1 (DR4) a TRAIL-R2 (DR5). Jeho schopnost indukovat apoptózu nezávisle na statusu p53 a selektivně zabíjet rakovinné buňky in vitro a in vivo zapříčinila, že tento ligand patřící do rodiny cytokinů TNF se jevil atraktivním cílem výzkumu terapie nádorových onemocnění. Avšak rezistence mnoha primárních nádorových buněk, neuspokojivý výsledek klinických testů a nedávné studie, které ukazují protichůdné výsledky a to konkrétně, že TRAIL může za specifických podmínek podporovat místo toho, aby inhiboval progresi nádorů, vyvolaly v oblasti výzkumu signalizace indukované ligandem TRAIL nové množství otázek, které je potřeba zodpovědet. Ačkoliv jsou oba receptory DR4 a DR5 rovnoměrne exprimovány, různé typy nádorů vykazují preferenci pro jeden nebo druhý z receptorů. Relativní účast signalizace DR4 a DR5 indukované TRAIL ligandem je málo známá. Abychom analyzovali signalizaci ligandu TRAIL specifickou pro jednotlivé receptory, připravili jsme trimerizované varianty rekombinantního lidského ligandu TRAIL, značené pomocí Strep-tag, s vysokou afinitou pro receptory DR4 nebo DR5. Zjistila jsem, že narozdíl od pankreatických rakovinových buňek PANC-1 rezistentních k apoptóze indukované ligandem TRAIL, probíhá tvorba komplexu DISC a počáteční autoaktivace kaspázy-8 v rezistentních kolorektálních buňkách HT-29 srovnatelně jak v buňkách aktivovaných DR4, tak i DR5 ligandem. Apoptóza indukovaná ligandem TRAIL probíhala v obou buněčných liniích mnohem efektivněji prostřednictvím receptoru DR5. Potlačení exprese receptorů DR4 a DR5 pomocí shRNA v buňkách HT-29 také ukázalo na významnější přínos receptoru DR5 v apoptóze indukované ligandem TRAIL. Na rozdíl od apoptotické buněčné smrti jsem nezaznamenala statisticky významné rozdíly v nekroptotické signalizaci, která byla srovnatelně aktivována jak ligandy specifickými pro DR4, tak i DR5 receptor. Aktivace dalších signálních drah, zahrnujících NF-κB a stresové kinázy p38 a JNK, probíhala za apoptotických podmínek hlavně DR5- dependentním způsobem, zatímco tyto signalizační cesty byly v průběhu nekroptózy srovnatelně aktivovány. V dizertační práci jsem dále také ukázala, že sekundární metabolit streptomycét Manumycin A je ve srovnání s příbuzným Manumycinem B nebo Asukamycinem účinným senzitizátorem apoptózy indukované ligandem TRAIL v buněčných liniích RKO a SW-620 kolorektálního karcinomu. Dokázala jsem, že inkubace RKO a SW-620 s Manumycinem A v kombinaci s TRAIL ligandem nebo ABT199/737, vedla ke statisticky významnému zvýšení apoptózy. Také jsem ukázala, že společná inkubace Manumycinu A s ligandem TRAIL vedla k silnější aktivaci kaspáz -8 / -9 a kaspázy-3, stejně jako k zvýšenému šťepení proteinů PARP a tBid. Důležité bylo zjištění, že tento ko-aktivační efekt je pravděpodobně způsoben produkcí ROS generovaných mitochondriemi. Závěrem, údaje ze spolupráce s Vladimírem Vinarským a kol. ukazují, že lidské embryonální kmenové buňky (hESC) a lidské pluripotentní kmenové buňky (hiPSC) exprimují receptory DR4 i DR5, ale jsou rezistentní vůči apoptóze indukované ligandem TRAIL. Souběžná inkubace s inhibitorem translace homoharringtoninem a ligandem TRAIL vedla k senzitizaci buňek k apoptóze indukované ligandem TRAIL a ke snížení exprese dvou antiapoptotických proteinů Mcl- 1 a cFLIP. Ukázala jsem, že potlačení exprese cFLIP pomocí shRNA vedla ke zvýšené citlivosti hESC, a že cFLIP pravděpodobně představuje důležitý regulační uzel ve vňejší dráze apoptózy indukované ligandem TRAIL v lidských pluripotentních kmenových buňkách. Souhrnně vzato, představila jsem první systematický pohled na DR4-/DR5-specifickou signalizaci v kolorektálních a pankreatických rakovinných buňkách, kde jsem použitím několika přístupů prokázala, že pro-apoptotická, ale ne nekroptotická, receptor-specifická signalizace ligandu TRAIL může v kontrastu s posledními studiemi do značné míry probíhat prostřednictvím receptoru DR5. Také jsem ukázala, že Manumycin A je efektivním senzitizátorem apoptózy indukované ligandem TRAIL a poskytla jsem první důkaz, že pluripotentní kmenové buňky, nezávisle na jejich původu, exprimují kanonické složky vnějšího apoptotického systému a vlivem stresových faktorů mohou aktivovat apoptózu zprostředkovanou receptory indukující buňečnou smrt.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT TRAIL ligand can trigger apoptosis of permissive human cells via engagement of its two pro- apoptotic receptors TRAIL-R1 (DR4) and TRAIL-R2 (DR5). Its ability to induce apoptosis independently on p53 status and to selectively kill cancer cells in vitro and in vivo made this ligand an attractive target in cancer research. However, acquired resistance of primary cancer cells, unsatisfactory outcome of clinical trials and recent studies arguing that TRAIL might under specific conditions promote cancer progression, opened new plethora of questions, which need to be addressed. Though both receptors DR4 and DR5 are ubiquitously expressed, different types of tumours show preference for either of the receptors. The relative participation of DR4 and DR5 in TRAIL- induced signalling is still largely unknown. To analyse TRAIL receptor-specific signalling, I prepared Strep-tagged, trimerised variants of recombinant human TRAIL ligands with high affinity for either DR4 or DR5 receptor. Using these receptor-specific ligands, I examined a contribution of individual pro-apoptotic receptors to TRAIL-induced signalling pathways. I found that in TRAIL resistant colorectal HT-29 cells but not in pancreatic PANC-1 cancer cells, DISC formation and initial caspase-8 processing proceeded comparably in both DR4- and DR5-activated receptor complexes. However, TRAIL-induced apoptosis proceeded in both cell lines predominantly via DR5 receptor. ShRNA-mediated downregulation of DR4 or DR5 receptors in HT-29 cells also pointed to a stronger contribution of DR5 in TRAIL-induced apoptotic signalling. In contrast to TRAIL-induced apoptosis, I did not observed significant differences in necroptotic signalling activated either by DR4- or DR5-specific ligands. Activation of auxiliary signalling pathways involving NF-κB and stress kinases p38 and JNK proceeded under apoptotic conditions mainly in a DR5-dependent manner, while these kinase pathways were during necroptosis similarly activated. In addition to TRAIL receptor-specific signalling this Thesis introduces Manumycin A (Man A) as an effective sensitizer of TRAIL-induced apoptosis in colorectal cancer cell lines RKO and SW-620. I documented that treatment of RKO and SW-620 with Manumycin A in combination with TRAIL ligand or ABT-199/737 led to statistical increased apoptosis and co-treatment of these cells with Man A and TRAIL WT led to stronger activation of caspases -8/ -9 and caspase-3 as well as increased processing of caspase-3 targets PARP and Bid proteins. Importantly I found out that this sensitizing effect is most probably related to the enhanced production of likely mitochondrial ROS in ManA-treated cells. Additionally, data from the collaborative project on human embryonic stem cells (hESC) and human-induced pluripotent stem cells (hiPSC) showed that despite expression of both DR4 and DR5 receptors in these cells, they were naturally resistant to TRAIL-induced apoptosis. However, their pre-treatment with homoharringtonine led to decrease of expression of two anti-apoptotic proteins Mcl-1 and cFLIP and to their sensitization to TRAIL-induced apoptosis. Similarly shRNA-mediated downregulation of cFLIP led to their enhanced apoptotic response to TRAIL and thus cFLIP likely represents the important regulatory node in TRAIL-induced apoptosis of human pluripotent stem cells. In summary, this study provided several new options how to overcome cellular resistance to TRAIL-triggered apoptosis and proposed answers to several questions raised in the field of TRAIL- induced signalling. It also provided first systematic insight into DR4-/DR5-specific signalling in colorectal and pancreatic cancer cells, where using a number of approaches documented that apoptotic and auxiliary but not necroptotic signalling in these cells largely relies on DR5 receptor. Moreover, I proposed secondary metabolite of Streptomyces Manumycin A as a novel potent sensitizer of TRAIL-induced apoptosis and I provided the first evidence that, irrespective of their origin, human stem cells express canonical components of the extrinsic apoptotic system and upon stress can activate death receptor-mediated apoptosis.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Zuzana Nahácka, Ph.D. 15.44 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Zuzana Nahácka, Ph.D. 1.92 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Zuzana Nahácka, Ph.D. 435 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Zuzana Nahácka, Ph.D. 433 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. PharmDr. Emil Rudolf, Ph.D. 262 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jan Vondráček, Ph.D. 305 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 176 kB