velikost textu

Regulation of cell cycle and DNA damage response in mouse oocytes.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Regulation of cell cycle and DNA damage response in mouse oocytes.
Název v češtině:
Regulace buněčného cyklu a odpovědi na DNA poškození v myších oocytech
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Alexandra Mayer, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Mgr. Petr Šolc, Ph.D.
Oponenti:
MUDr. Libor Macůrek, Ph.D.
doc. MUDr. Milan Macek, CSc.
Id práce:
113268
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová a buněčná biologie (P1529)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
2. 12. 2015
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Buněčný cyklus savčích oocytů je dočasně zastaven v průběhu profáze I. meiotického dělení a v tomto stádiu mohou oocyty přetrvávat až několik desítek let. V oocytech proto musí fungovat účinné mechanismy, které je udržují v profázi I a umožňují znovuzahájení meiózy, když je potřeba. Následně, správná segregace chromozomů během maturace oocytů je podmínkou pro vývoj zdravých potomků. Naším cílem bylo zjistit nové role AURKA a PLK1 kináz v regulaci buněčného cyklu. Použili jsme transgenní myši, které nadprodukují wild type (WT-) nebo neaktivní (kinase- dead, KD-) AURKA pouze v oocytech, a ke studiu PLK1 kinázy jsme použili specifický inhibitor BI2536, jehož účinnost je ověřená v somatických buňkách. Naše data ukazují, že jak AURKA tak PLK1 nejsou nezbytné pro znovuzahájení meiózy, i když obě kinázy se tohoto procesu účastní. Aktivní AURKA reguluje proces multiplikace mikrotubuly organizujících center (MTOC) v profázi I, což je první viditelná známka znovuzahajení meiózy. Aktivace AURKA je bifázní, proto primární nárůst počtu MTOC je tranzientní. Plná aktivace AURKA, která je potřebná pro stabilitu MTOC, vyžaduje aktivitu Cyklin-dependentní kinázy 1 (CDK1). Ukázali jsme, že PLK1 se účastní rozpadu jaderné membrány během znovuzahájení meiózy. Jak AURKA tak PLK1 se podílí na akumulaci centrozomálních proteinů na MTOC a na výstavbě dělícího vřeténka. V metafázi I (MI) PLK1 reguluje napojení kinetochorů na mikrotubuly a inhibice PLK1 brání správnému seřazení chromozomů do metafázní roviny a vede k aktivaci kontrolního bodu SAC (spindle assembly checkpoint) a zástavě buněčného cyklu v MI. Aktivita PLK1 v oocytech je podmínkou pro plnou aktivaci APC/C (anaphase promoting complex/cyclosome) a proto PLK1 je nezbytná pro vstup do anafáze I. Na rozdíl od PLK1, nadprodukce WT- nebo KD-AURKA nebrání meiotické maturaci. Během profáze I a meiotického zrání mohou být oocyty opakovaně vystaveny působení chemikálií, které vyvolávají poškození DNA. Také buněčný metabolismus může přispívat k endogennímu poškození DNA (kyslíkové radikály, replikace DNA, transkripce), a jeho včasná oprava může zvýšit míru přežití oocytů a zabránit vzniku abnormálních embryí. Studovali jsme reakci oocytů jak na endogenní dvouvláknové zlomy DNA (double strand breaks, DSBs), tak na DSBs vyvolané nízkou koncentrací radiomimetické drogy Neocarzinostaninu (NCS). Zjistili jsme, že nízké množství DSBs po ošetření NCS v profázi I vede ke vzniku chromozomálních fragmentů a opožděných chromozomů (tzv. lagging chromosomes) ale neaktivuje APC/C a nezpožďuje vstup do anafáze. Počet DSBs, stanovený podle γH2AX- markeru DSBs, se značně snížuje mezi profázi I a metafázi II v kontrolních i NCS ošetřených oocytech. Navíc, prodloužená kultivace oocytů v profázi I vede ke snížení počtu DSBs indukovaných NCS. Není to ATM, ale MRE11, která je nezbytná pro detekci γH2AX v profázi I a je zapojená do fosforylace H2AX během MI. Inhibice MRE11 pomocí mirinu během maturace vede ke vzniku anafázních můstku a také ke zvýšení množství DSBs v metafázi II. Narušená integrita DNA v oocytech po kultivaci v mirinu svědčí o roli MRE11 v opravě poškození DNA během zrání. V souhrnu naše data naznačují, že oprava DNA probíhá v profázi I a také po znovuzahájení meiózy.
Abstract v angličtině:
Abstract A specific feature of mammalian oocytes is a long prophase I arrest, which can be maintained for many years in humans. The oocytes must ensure robust mechanisms, which can keep them in prophase I, but effectively trigger meiotic resumption when required. Consequently, throughout the maturation of an oocyte, non-erroneous chromosome segregation is a prerequisite for the generation of healthy offspring. In this study we aimed to investigate the new roles of Aurora A (AURKA) and polo-like kinase 1 (PLK1) in the regulation of the cell cycle progression. For this purpose, we used transgenic mice that specifically overexpress wild type (WT-) or kinase-dead (KD-) AURKA in oocytes only, and to study PLK1 we treated oocytes with BI2536, a small molecule inhibitor known to specifically inhibit PLK1 in somatic cells. Our data show, that both AURKA and PLK1 are not essential for meiotic resumption, however they participate in this process. Active AURKA regualtes the increase in microtubule organizing centers (MTOC) in prophase I, which is the first visible marker of resumption of meiosis in oocytes. AURKA activation is biphasic, and the initial increase in MTOC is transient, while full AURKA activation needed for the stability of MTOC requires the activity of Cyclin-dependent kinase 1 (CDK1). We show that PLK1 participates in meiotic resumption by promoting nuclear envelope breakdown. Both AURKA and PLK1 are needed to recruit centrosomal proteins to MTOC in order to promote normal spindle formation. In metaphase I (MI) PLK1 is needed for stable kinetochore-microtubule attachment, and inhibition of PLK1 leads to MI arrest with misaligned chromosomes activating the spindle assembly checkpoint (SAC). We show that PLK1 is required for the full activation of the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C) and is therefore essential for entry into anaphase I. In contrast, overexpression of WT- or KD- AURKA does not interfere with oocyte maturation. During prophase I arrest and maturation the oocytes may be repeatedly exposed to drugs which induce DNA damage. Alternatively, endogenous DNA lesions may arise from cell’s own metabolism (oxygen radicals, DNA replication and trascription), and their timely repair may increase the survival of oocytes and prevent genetic abnormalities in the embryos. We studied the response of oocytes to endogenous DNA double strand breaks (DSBs), and to DSBs induced by low concentration of the radiomimetic drug Neocarzinostatin (NCS). We found that low levels of DSBs induced by NCS in prophase I increase the incidence of chromosome fragments and lagging chromosomes but do not lead to APC/C activation and anaphase onset delay. The number of DSBs, represented by γH2AX foci, significantly decreases between prophase I and metaphase II in both control and NCS-treated oocytes. Besides, prolonged incubation of oocytes arrested in prophase I decreases the number of NCS-induced DSBs. Meiotic recombination 11 homologue (MRE11), but not Ataxia telangiectasia mutated (ATM), is essential for DSBs detection in prophase I and is involved in H2AX phosphorylation during MI. Inhibiting MRE11 by mirin during meiotic maturation results in anaphase bridges and also increases the number of γH2AX foci in metaphase II. Compromised DNA integrity in mirin-treated oocytes indicates a role for MRE11 in the DNA repair during meiotic maturation. Collectively, our data suggest that DNA repair occurs in prophase I arrested oocytes and after resumption of meiosis.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Alexandra Mayer, Ph.D. 29.84 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Alexandra Mayer, Ph.D. 251 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Alexandra Mayer, Ph.D. 246 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Alexandra Mayer, Ph.D. 1.07 MB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Libor Macůrek, Ph.D. 193 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Milan Macek, CSc. 201 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 493 kB