velikost textu

Studies of the Mouse polyomavirus: properties of the minor structural proteins, requirements for virion productive trafficking to the nucleus and observed side effects of DNA transfection.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studies of the Mouse polyomavirus: properties of the minor structural proteins, requirements for virion productive trafficking to the nucleus and observed side effects of DNA transfection.
Název v češtině:
Studium myšiho polyomaviru:: vlastnosti minoritních strukturních proteinů, nároky pro produktivní transport virionu do buněčného jádra a vedlejší efekt transfekce DNA do buněk.
Typ:
Disertační práce
Autor:
Sandra Huerfano- Meneses, M.Sc., Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc.
Oponenti:
MUDr. Zora Mělková, Ph.D.
RNDr. Milan Reiniš, CSc.
Id práce:
112983
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
26. 2. 2014
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt V této práci jsme zkoumali roli minoritních strukturních proteinů VP2 a VP3 Myšího polyomaviru (MPyV) v replikačním cyklu viru a také specifické aspekty pohybu internalizovaných virionů MPyV buňkou směrem k buněčnému jádru. Disertační práce je rozdělena do tří kapitol. První kapitola řeší otázky interakce VP2 a VP3 se strukturami hostitelských buněk a také roli těchto proteinů v pozdních stádiích virové infekce. Druhá kapitola se zabývá rolí pozdních endozómů, recyklujících endozómů a aktinového cytoskeletu v produktivním transportu MPyV. Kapitola tři obsahuje výsledky studia interferonové (IFN) odpovědi indukované nukleofekcí DNA do buněk. Této poslední studii předcházela analýza putativních změn hladin transkripce buněčných genů (microarray analysis) vyvolaných transientní produkcí VP2 nebo VP3. V první kapitole jsme ukázali, že oba minoritní strukturní proteiny, pokud jsou produkovány v buňkách samostatně (bez VP1) jsou velmi cytotoxické a indukují rychlou, na kaspázách závislou apoptózu. Imunoelektronová a konfokální mikroskopie odhalila afinitu obou proteinů k endobuněčným membránám. VP2 i VP3 byly detegovány na poničených membránách endoplasmatického retikula (ER) a mitochondrií. Interakce minoritních proteinů s membránami, působící poškození organel jako ER a mitochondrie, je zjevně příčinou cytotoxicity těchto proteinů. S využitím mutovaného genomu MPyV, ve kterém byly zrušeny AUG kodony pro zahájení translace VP2 a VP3, bylo ukázáno, že oba proteiny přispívají jen z části k apoptotickým procesům pozorovaným během infekce a jsou postradatelné pro proces buněčné destrukce na konci lytického cyklu MPyV. Ve druhé části práce jsou prezentovány výsledky ukazující, že produktivní transport MPyV vyžaduje průchod virionů pozdními endozómy spojenými s GTPázou Rab 7, zatímco průchod recyklujícími endozómy a funkce GTPázy Rab 11 jsou pro produktivní infekci MPyV postradatelné. Dále bylo zjištěno, že produktivní pohyb virionů vedoucí k dopravě virového genomu do jádra nevyžaduje aktinová mikrofilamenta ani dynamický aktin. Konečně, ve třetí části bylo zjištěno, že transfekce myších fibroblastů dvouvláknovou DNA s použitím metody nukleofekce indukuje silnou IFN odpověď, aktivuje buněčné odpovědi na poškození DNA a inhibuje buněčnou proliferaci. IFN odpověď byla závislá na sekvenci DNA, jelikož delece specifických sekvencí použitých plasmidů snížila hladiny IFN ϐ. Zajímavé je, že pokud byly buňky transformovány s použitím kationtového polymeru - Turbofect, byly nalezeny pouze velmi nízké hladiny IFN odpovědí. Ukázalo se, že mechanismus IFN indukce nukleofekcí není spojen s rozpoznáním CpG “Toll like” receptorem 9, což naznačuje, že rozpoznání DNA je zprostředkováno cytosolickými DNA senzory. DNA nukleofekce aktivovala transkripční faktor NF-ҡB avšak nikoliv interferon regulující faktor 3. Faktor NF-ҡB je tedy patrně součástí signální dráhy vedoucí k produkci IFN. Výsledky upozorňují na silný vedlejší efekt nukleofekce.
Abstract v angličtině:
Abstract In this thesis, we aimed to investigate the role of Mouse polyomavirus (MPyV) minor structural proteins, VP2 and VP3 in the viral life cycle as well as to study specific aspects of the productive trafficking of the virus. The thesis is divided into 3 chapters as follows: chapter 1 addresses questions about the interaction of the minor structural proteins, VP2 and VP3, of MPyV with host cells and their role during late stages of virus infection. In the chapter 2, aspects concerning the role of late endosomes, recycling endosomes and actin cytoskeleton in MPyV productive infection are addressed and in the chapter 3, results of studies of interferon (IFN) responses induced after DNA nucleofection are presented. The study in chapter 3 was preceded by a microarray analysis primary performed to reveal cell responses to the presence of the minor proteins within host cells. We showed that both MPyV minor structural proteins, VP2 and VP3, when produced individually (without VP1) are highly cytotoxic, inducing fast, caspase dependent apoptosis. Immuno-electron and confocal microscopy revealed affinity of both proteins to endocellular membranes. Both VP2 and VP3 were found to be bound to damaged ER and mitochondrial membranes. Interaction of the proteins with membranes causing physical damage of organelles such as ER and mitochondria is the most probable reason for the toxicity induced by VP2 and VP3. By using mutated MPyV genome, lacking start codons for VP2 and VP3, it was shown that the minor structural proteins contribute to apoptotic processes during infection only moderately and are dispensable for cell destruction at the end of the lytic cycle of MPyV. In the second part, we showed that productive transport of MPyV requires virus sorting through Rab 7 positive late endosomal compartments while sorting through Rab11 positive recycling endosomes is dispensable for the productive infection. Further, we present evidence that MPyV does not require actin cytoskeleton and its dynamics for its productive transport. Finally, we demonstrated that nucleofection of dsDNA in mouse fibroblasts induces strong IFN response, activates DNA damage response and inhibits cell proliferation. IFN response was proven to be sequence dependent as deletion of specific plasmid sequences decreased the levels of IFN-β. Interestingly, only low levels of IFN response were found when cells were transfected using the cation polymer-Turbofect. Further, we found that the mechanism of IFN induction by nucleofection is not connected with Toll like receptor 9 recognition of CpG’s, thus suggesting that sensing of DNA is mediated by cytosolic DNA sensors. DNA nucleofection was found to activate NF-ҡB transcription factor but not Interferon regulatory factor 3, suggesting a role of NF-ҡB in the early signalling leading to the IFN production. The results point to a strong side effect of nucleofection.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Sandra Huerfano- Meneses, M.Sc., Ph.D. 4.15 MB
Stáhnout Příloha k práci Sandra Huerfano- Meneses, M.Sc., Ph.D. 1.59 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Sandra Huerfano- Meneses, M.Sc., Ph.D. 188 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Sandra Huerfano- Meneses, M.Sc., Ph.D. 165 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Sandra Huerfano- Meneses, M.Sc., Ph.D. 395 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Zora Mělková, Ph.D. 128 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Milan Reiniš, CSc. 1.21 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 770 kB