velikost textu

Synthesis of Neurosteroids: Modulators of NMDA Receptor

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Synthesis of Neurosteroids: Modulators of NMDA Receptor
Název v češtině:
Syntéza neurosteroidů: modulátorů NMDA receptoru
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Eva Šťastná, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Hana Chodounská, CSc.
Oponenti:
Doc. RNDr. Eva Klinotová, CSc.
Prof. RNDr. Pavel Drašar, DSc.
prof. RNDr. Richard Hampl, DrSc.
Id práce:
112828
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra organické chemie (31-270)
Program studia:
Organická chemie (P1402)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
21. 4. 2009
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Organic and Nuclear Chemistry Karlova Universita v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra organické chemie a jaderné chemie Mgr. Eva Šťastná Synthesis of Neurosteroids: Modulators of NMDA receptor Syntéza neurosteroidů: modulátorů NMDA receptoru PhD. Thesis Abstract Autoreferát disetační práce Praha 2009 Prague, 2009 Scientific Presentations and Posters Papers • Šťastná E.: Diazomethane (CH2N2). Synlett, 2007,15,2454. • Stastna E., Chodounska H., Pouzar V., Kapras V., Borovska J, Cais O., L Vyklicky L.: Synthesis of C3, C5, and C7 pregnane derivatives and their effect on NMDA receptor responses in cultured rat hippocampal neurons. Steroids 2009, 74, 256-263. • Kapras V., Šťastná E., Chodounská H., Pouzar V., Krištofíková Z.: Preparation of steroid sulfamates and their interaction with GABAA receptor. Coll. Czech. Chem. Comm., submitted, manuscript number CCCC/2008/000187. • Eignerová B., Slavíková B., Buděšínský M., Stastna E., Kotora M.: Synthesis of Fluorinated Brassinosteroids Based on Alkane Cross-Metathesis and Preliminary Biological Assessment. J. Org. Chem., under revision, manuscript number jo-2009- 002079. Patents • Stastna E., Chodounska H., Cais O., Vyklicky L., Kapras V., Pouzar V., Kohout L.: Steroidní anionické sloučeniny, způsob jejich výroby a jejich použití. Pregnane anionic compounds, the methods of production and their use. Filed 10th July 2008. CZ PV 2008-434. Presentations • Šťastná Eva, Pouzar Vladimír, Chodounská Hana: Stability of 7-OH epimers of 3β-hydroxy-5-en steroids. Conference of the Czech Chemical Society 2003. Nymburk, Czech Republic. Chemické listy 2003,97,1128. Awarded „One of the best student lecture of the conference“. • Eva Šťastná, Hanna Chodounská: Synthesis and hydrophilic derivatization of 3α,7α- dihydroxy-5β-pregnan-20-one. Chemické listy 2005,99,870. • Hana Chodounská, Jiří Urban, Eva Šťastná, Miloš Buděšínský: Synthesis and hydrophilic derivatization of 3α,7α-dihydroxy-5β-pregnan-20-one. XXI Conference on Isoprenoids. Bialystok-Bialowieza, Poland, 23-29 September 2005. Book of Abstracts, p. 71. Awarded: “One of the five best student lectures without sequence assessment.” • Eva Šťastná and Hana Chodounská: Utilization of vinyl nonaflates and vinyl triflates in palladium catalysed alkoxycarbonylation. VII Meeting of young researches in Biology, Biochemistry and Chemistry. Devět Skal, Czech Republic, 12-16 June 2007. Chemické listy 2007, 101, p. 458. Posters • Hana Chodounská, Jiří Urban, Eva Šťastná, Miloš Buděšínský: Synthesis of 3-carboxy derivatives of 5β-pregnan-20-one. Conference of the Czech Chemical Society 2004. Nymburk, Czech Republic. Chemické listy 2004,98,1047. • Hana Chodounská, Jiří Urban, Eva Šťastná, Miloš Buděšínský: Synthesis of 3-carboxy derivatives of 5β-pregnan-20-one. XXI Conference on Isoprenoids. Bialystok-Bialowieza, Poland, 23-29 September 2005. Book of Abstracts, p.62. • Eva Šťastná and Hana Chodounská: 3α,7α-Dihydroxy-5β-pregnan-20-one and 3α,7α- dihydroxy-5α-pregnan-20-one: Synthesis and hydrophilic derivatization. VI Meeting of young researches in Chemistry, Biochemistry, Molecular Biology. Devět Skal, Czech Republic, 14-17 June 2006. Chemické listy 2006,100,407. • Eva Šťastná and Hana Chodounská: Utilization of vinyl nonaflates and vinyl triflates in palladium catalysed alkoxycarbonylation. XVI Simposio Nacional de Quimica Organica XVI Sinaqo. Mar del Plata, Argentina, 11-14 November, 2007. Book of Abstracts, p. SO 40. • Černý I., Šťastná E., Pouzar V., Chodounská H.: Selectivity in reductions of 7-ketosteroids with sodium borohydride. Pokroky v organické, bioorganické a farmaceutické chemii – “Liblice 2008”. Chemické listy, 2008,102,1030. Curriculum vitae General Information Name: Eva Šťastná Born: on November 28, 1980 in Ostrava (Czech Republic) Nationality: Czech Contact Address: Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic Email: stastna@uochb.cas.cz Education 1999-2004 Mgr. degree in organic chemistry at Charles University in Prague, Faculty of Science. The Diploma work was done at the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic under supervision of RNDr. Hana Chodounská CSc.: Synthesis and stability of derivatives of 7-hydroxydehydroepiandrosterone Since Sept. 2004 PhD. course in Organic Chemistry, at the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic under supervision of RNDr. Hana Chodounská CSc.: Synthesis of Neurosteroids: Modulators of NMDA receptor 1. Introduction NMDA receptors (N-methyl-D-aspartate) are ligand-gated ion channels permeable to calcium and play a critical role in excitatory synaptic transmission and synaptic plasticity1. They possess distinct binding sites for exogenous and endogenous ligands. These include binding sites for the agonist L-glutamic acid, co-agonist glycine, open channel blockers, polyamines, and also neurosteroids2. L-glutamic acid (glutamate) is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system. However, under many pathological conditions the extracellular glutamate concentrations may result in over-excitation, which could induce irreversible processes in neurons including cell death - excitotoxicity3-6. Neurosteroids are compounds synthesized in the nervous tissue from cholesterol and/or from circulating precursors subsequently modified to neuroactive compounds7. Without a doubt, a lot of aspects can influence the nature and extent of the neurosteroid modulation. One of them is a chemical structure of neurosteroid. The most important results of structure-activity relationship studies can be summarized as follows10-12: • 20-Oxo-pregn-5-en-3β-yl sulfate (PS), an endogenously occurring neurosteroid, acts as a combined positive and negative modulator of NMDA receptors8,9. Nevertheless, the sulfate group is not essential for potentiation of the NMDA response, but a negatively charged group at C-3 is required for activity. • The hook shaped steroid structures associated with 5β-stereochemistry favors receptor inhibition; whereas the more planar ring structure of 5a-pregnanes favors potentiation of NMDA receptors. • The addition of a ketone group at C-7 or C-11 results in complete loss of activity, whereas 11β-hydroxy-PS is weak inhibitor. • Compounds with modifications to the C-17 side chain, such as 20β-hydroxy- PS and 21-acetoxy-PS, still potentiate the NMDA response. Removal of the ring D side chain, as in dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), markedly attenuated activity. • 17-Hydroxy-PS, which differs from PS by the presence of a hydroxyl group at C-17, has activity similar to that of PS. Structure-activity studies on NDMARs which could allow defining a binding site of neurosteroids on NMDARs could facilitate the creation of concept of a molecular template for design and development of novel therapeutic entities. 2. Synthesis of C-3 and C-7 Substituted Pregnane Derivatives The first part of the Thesis was focused on the synthesis of C-3 and C-7 substituted 5α- and 5β-pregnan-20-one derivatives (Scheme 2 and 3). In both series, three common methodologies were used to prepare desired products. Firstly, starting compounds 4 and 16 (Scheme 1) were treated with succinic anhydride in pyridine under catalysis of 4-dimethylaminopyridine to give desired hemisuccinates 5 and 17 in good yields. Secondly, starting compounds 4 and 16 were treated with sulfur trioxide pyridine complex in chloroform to afford pyridinium salts of sulfates 6 and 18. And finally, starting compounds 4 and 16 were converted to derivatives 11 and 23 by a sequence of reactions: protection of 3-hydroxy group with tert-butyldimethylsilyl group, hydrolysis of 7-acetoxy group, followed by reaction of free 7-hydroxy groups with nicotinoyl chloride hydrochloride and finally, the tert-butyldimethylsilyl group was selectively cleaved to hydroxy derivative 10 and 22. Those were subsequently transformed to pyridinium salts of sulfates 11 and 23. O O HO OAc HO OAc H H 4 16 Scheme 1 – Compounds 4 and 16 O (a) O 4 or 16 HO O OAc 5, R1 = 5α-H R1 O 17, R1 = 5β-H O (b) 4 or 16 O N O S O OAc 6, R1 = 5α-H R1 1 H O 18, R = 5β-H Scheme 2 - Synthesis of compounds 5, 17 and 6, 18. Reaction conditions: (a) Succinic anhydride, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, 140 °C; (b) sulfur trioxide pyridine complex, CHCl3. O O (a) (b) 4 or 16 TBDMSO OAc TBDMSO OH R1 1 R1 7, R = 5α-H 8, R1 = 5α-H 19, R1 = 5β-H 1 20, R = 5β-H O O (c) (f) O O O R2O N O S O R1 O R1 O H O N N 1 2 9, R = 5α-H, R = TBDMS (d 1 2 11, R1 = 5α-H 10, R = 5α-H, R = H 1 23, R = 5β-H 21, R1 = 5β-H, R2 = TBDMS (e) 1 2 22, R = 5β-H, R = H Scheme 3 - Synthesis of compounds 7-11 and 19-23. Reaction conditions: (a) tert-butyldimethylsilyl chloride, imidazole, DMF; (b) KOH, EtOH, benzene, 60 °C; (c) nicotinoyl chloride hydrochloride, 4-dimethylaminopyridine, pyridine; (d) p-toluenesulfonic acid monohydrate, MeOH, rt; (e) tetrabutylammonium fluoride, THF, rt; (f) sulfur trioxide pyridine complex, CHCl3. 3. Synthesis of 3-Steroid Carboxylic Acids The second part of the Thesis was focused on the synthesis of 3-steroid carboxylic acids utilizing palladium catalyzed alkoxycarbonylation of steroid triflates and nonaflates (Scheme 4). A methodology was firstly examined on cholestane and protected pregnane derivatives. Then, the methodology was utilized on 5α- and 5β-pregnane skeletons (44 and 46): 3-keto group was converted to enoltriflates or enolnonaflates which undergo the palladium catalyzed alkoxycarbonylation with carbon monoxide in methanol and DMF to afford unsaturated methyl esters. Catalytic hydrogenation on palladium catalyst followed by basic hydrolysis gave desired carboxylic acids (60-62). O O O R1 O H R2 H R1 R2 __ __ 44, 5α-H 60 5α-H H COOH 46, 5β-H 61 5β-H COOH H 62 5β-H H COOH Scheme 4 – Synthesis of Compounds 60-62. 4. Synthesis of 2-(Steroid-3-yl)propandioic Acid and 2-(Steroid-3- yl)acetic Acid The third part of the Thesis was focused on the synthesis of compounds 67 and 70 (Scheme 5): 3-hydroxy group of the starting material 63 was converted to tosylate, 20-keto group was protected as acetal, and finally SN2 reaction with sodium salt of dimethyl malonate gave methyl ester of dicarboxylic acid 66. Basic hydrolysis and deprotection of 20-acetal group afforded diacid 67 and decarbethoxylation followed by basic hydrolysis and deprotection of 20-acetal gave monoacid 70. O O O O HO (MeOOC)2HC 66 (HOOC)2HC 67 H 63 H H O HOOCH2C 70 H Scheme 5 - Synthesis of compounds 67 and 70. 5. Synthesis of Steroid Carboxylic Acids via Wadsworth-Horner- Emmons Reaction (WHE) The fourth part of the Thesis was focused on the synthesis of carboxylic acids via Wadsworth-Horner-Emmons reaction (WHE): 3-ketones 71 and 72 were treated with intermediates prepared from commercially available triethyl 2-phosphonoacetate (Scheme 6), triethyl 2-phosphonopropionate (Scheme 7), triethyl 2-phosphonobutyrate (Scheme 8), and triethyl 4-phosphonocrotonate (Scheme 9) with NaH in THF at low temperatures to afford particular ethyl esters. Those were then treated with potassium hydroxide to give carboxylic acids except acid 98 which was prepared by acid hydrolysis, because basic hydrolysis led only to isolation of starting material. The hydrolysis did not afford probably due to steric reasons. R1 R2 __ __ O O 89 5α-H H COOH 90 5α-H COOH H R1 91 5β-H H COOH O H 71, 5α-H R2 H 92 5β-H COOH H 72, 5β-H Scheme 6 – Synthesis of compounds 89-92. R1 R2 __ __ O O 93 5α-H CH3 COOH 94 5α-H COOH CH3 R1 95 5β-H CH3 COOH O H 71, 5α-H R2 H 96 5β-H COOH CH3 72, 5β-H Scheme 7 – Synthesis of compounds 93-96. O O R1 R2 __ 1 __ R 98 5α-H COOH CH2CH3 O H 71, 5α-H R2 H 72, 5β-H Scheme 8 – Synthesis of compound 98. R1 R2 __ __ O O 101 5α-H H CH=CH-COOH 102 5α-H CH=CH-COOH H R1 103 5β-H H CH=CH-COOH O H 71, 5α-H R2 H 104 5β-H CH=CH-COOH H 72, 5β-H Scheme 9 – Synthesis of compounds 101-104. 6. Luche Reduction of Saturated Steroid Ketones The last part of the Thesis was focused on analysis of steroid alcohols prepared by sodium borohydride reduction of saturated steroids under the conditions of Luche reduction. A serie of saturated steroid ketones was reduced by sodium borohydride in a mixture of THF and methanol under the catalysis of cerium chloride heptahydrate (CeCl3·7H2O), samarium iodide, and anhydrous cerium chloride. The mixtures of alcohols were firstly analyzed by 1H NMR and then, the exact ratios were determined by HPLC analysis. The results were compared with results obtained by sodium borohydride reduction in which none catalyst was used. The influence of neighbouring substituents was also discussed. O R R H H H 105 O O 106, R = OH 109, R = OH 107, R = OAc 110, R = OAc 108, R = OTBDMS 111, R = OTBDMS O O O OBz O COOMe HO O H H H 112 113 114 O O O AcO AcO AcO H 115 116 40 The sodium borohydride reductions under catalysis of Ce3+ or Sm3+ allow changing of the ratio of axial/equatorial, pseudoaxial/psedoequatorial, and R/S alcohols. The most significant changes were observed in case of 7- and 12-ketone steroid (112, 114). Considerably promising results were also obtained in case of 20-ketone reduction (40) which Sm3+ catalyzed reduction was comparable with results obtained by anhydrous Ce3+ catalysis. 7. Conclusions Within the Thesis I have prepared a serie of C-3 and C-7 substituted pregnane derivatives and a serie of carboxylic acids of 5α- and 5β-pregnan-20-one having carboxylic group joined directly to steroid in position 3 or by spacer of 1-3 carbon atoms. These compounds were tested at the Department of Cellular Neurophysiology at the Institute of Physiology, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic. In general, the results can be summarized as follows: (i) 5β-H neurosteroids are rather inhibitors, whereas 5α-H derivatives rather potentiate; (ii) the binding site for steroids on NMDA receptor rather adopt bulky substituents; (iii) the activity of derivative with two carboxylic acids (67) did not significantly change in comparison with derivative (70) bearing only one carboxyl group; (iv) carboxylic acids prepared via WHE reaction in general potentiate, nevertheless the ambiguous results demand further investigation. 1. Úvod NMDA receptory (N-methyl-D-aspartate) jsou ligandem aktivované iontové kanály propustné pro vápenaté ionty, které hrají klíčovou roli v synaptickém přenosu a jeho plasticitě1. NMDA receptory mají odlišná vazebná místa pro exogenní a endogenní ligandy, mezi které patří vazebná místa pro agonistu – L-glutamovou kyselinu, koagonistu – glycin, dále např. Pro blokátory iontového kanálu, polyaminy a také neurosteroidy2. L-glutamová kyselina (glutamát) je hlavní excitační neurotransmiter centrální nervové soustavy. Za určitých patologický podmínek však vysoká koncentrace extracelulárního glutamátu může vést k nadměrné excitaci, jejímž důsledkem mohou být irevesibilní procesy na neuronech, které mohou vést až k buněčné smrti3-6. Literatura tento jev popisuje jako tzv. excitotoxicitu. Termín neurosteroidy označuje skupinu steroidních látek syntetizovaných v nervové tkáni z cholesterolu nebo ze steroidních prekurzorů z periferních zdrojů7. Charakteristika a míra ovlivnění NMDA receptoru neurosteroidem závisí na mnoha faktorech. Jedním z nich je chemická struktura steroidu. Následující body shrnují současné poznatky strukturně aktivitních studií vlivu steroidů na NMDA receptory 10-12: • 20-Oxo-pregn-5-en-3β-yl sulfát (PS), endogenní neurosteroid, působí jako positivní i negativní modulátor NMDA receptoru8,9. Sulfátová skupina může být nahrazena jiným, negativně nabitým substituentem v poloze C-3 . • Neurosteroidy s konfigurací 5β-H jsou spíše inhibitory, 5α-H neurosteroidy spíše potencují odpověď NMDA receptoru. • 11β-hydroxy-PS je slabý inhibitor, zatímco přítomnost keto skupiny v poloze C-7 nebo C-11 vede ke kompletní ztrátě aktivity. • Sloučeniny s modifikací 17β-postranního řetězce jako např. 20β-hydroxy-PS a 21-acetoxy-PS potencují odpověď NMDA receptoru. Odtranění postranního řetězce, jako např. 17-oxo-androst-5-en-3β-yl sulfátu (DHEAS), výrazně snížilo aktivitu. • 17-Hydroxy-PS, který se liší of PS přítomností α-hydroxylové skupiny v poloze C-17, má srovnatelnou aktivitu s PS. Studium vztahů mezi strukturou a aktivitou neuroaktivních steroidů na NMDA receptorech by mohlo vést k nalezení vazebného místa, a tak usnadnit vytvoření konceptu molekulárního templátu pro vývoj nových terapeutických prostředků k medikaci chorob spojených s excitotoxicitou. 2. Syntéza C-3 a C-7 substituovaných pregnanových derivátů V první části dizertační práce byla zaměřena na přípravu C-3 a C-7 substituovaných 5α- a 5β-pregnanových derivátů (Obr. 2 a 3). Byly použity tři základní reakční sekvence pro přípravu žádaných derivátů. Hemisukcináty 5 a 17 byly připraveny reakcí výchozích látek 4 a 16 (Obr. 1) s anhydridem kyseliny jantarové a 4-dimethylaminopyridinem a pyridiniové soli sulfátů 6 a 18 reakcí s komplexem pyridin-oxid sírový. Pro přípravu derivátů 11 a 23 byla použita následující reakční sekvence: 3-hydroxy skupiny byly nejprve ochráněny jako tert-butyldimetylsilyl deriváty (TBDMS), 7-acetátové skupiny byly hydrolyzovány, aby posléze byly takto připravené volné 7-hydroxy skupiny ochráněny reakcí s nikotinoyl chloridem hydrochloridem. Volné 3-hydroxylové skupiny, které vznikly štepením chráněných TBDMS derivátů, byly převedeny na pyridiniové soli sulfátů 11 a 23. O O HO OAc HO OAc H H 4 16 Obr. 1 – Látky 4 a 16 O (a) O 4 or 16 HO 5, R1 = 5α-H O OAc R1 O 17, R1 = 5β-H O (b) 4 or 16 O N O S O OAc 6, R1 = 5α-H R1 1 H O 18, R = 5β-H Obr. 2 – Syntéza látek 5, 17 a 6, 18. Reakční podmínky: (a) anhydrid kyseliny jantarové, pyridin, 4-dimethylaminopyridin, 140 °C; (b) komplex pyridin-oxid sírový, CHCl3. O O (a) (b) 4 or 16 TBDMSO OAc TBDMSO OH R1 1 R1 7, R = 5α-H 8, R1 = 5α-H 19, R1 = 5β-H 1 20, R = 5β-H O O (c) (f) O O O R2O 1 N O S O 1 R O R O H O N N 1 2 9, R = 5α-H, R = TBDMS (d 1 2 11, R1 = 5α-H 10, R = 5α-H, R = H 1 23, R = 5β-H 21, R1 = 5β-H, R2 = TBDMS (e) 1 2 22, R = 5β-H, R = H Obr. 3 – Syntéza látek 7-11 a 19-23. Reakční podmínky: (a) tert-butyldimethylsilyl chlorid, imidazol, DMF; (b) KOH, EtOH, benzen, 60 °C; (c) nikotinoyl chlorid hydrochlorid, 4-dimethylaminopyridin, pyridin; (d) monohydrát kyseliny p-toluensulfonové, MeOH, rt; (e) tetrabutylammonium fluorid, THF, rt; (f) komplex pyridin-oxid sírový, CHCl3. 3. Syntéza 3-steroidních karboxylových kyselin Druhá část dizertační práce byla zaměřena na přípravu 3-steroidních karboxylových kyselin pomocí palladiem katalyzované alkoxykarbonylace triflátů a nonaflátů (Obr. 4). Zvolená metodika byla nejprve vyzkoušena na cholestanovém a vhodně chráněném pregnanovém derivátu. Poté byla použita pro syntézu 3-karboxylových kyselin 5α- a 5β- pregnanových derivátů 44 a 46: 3-keto skupina byla transformována na směs enol triflátů a enol nonaflátů, které jsou velmi dobrou odstupující skupinou pro palladiem katalyzovanou alkoxykarbonylaci oxidem uhelnatým ve směsi metanol-DMF. Takto připravené nenasycené methyl estery byly katalytickou hydrogenací a posléze bazickou hydrolýzou převedeny na požadované karboxylové kyseliny (60-62). O O O R1 O H R2 H R1 R2 __ __ 44, 5α-H 60 5α-H H COOH 46, 5β-H 61 5β-H COOH H 62 5β-H H COOH Obr. 4 – Syntéza látek 60-62. 4. Syntéza 2-(steroid-3-yl)propandiové kyseliny a 2-(steroid-3- yl)octové kyseliny Třetí část dizertační práce byla zaměřena na přípravu dikarboxylové kyseliny 67 a kyseliny 70 (Obr. 5). Nejprve byla 3-hydroxylová skupina výchozí látky 63 ochráněna jako tosylát a 20-keto skupina jako acetal. Reakcí takto připraveného ochráněného derivátu se sodnou solí dimethyl-malonátu za refluxu v toluenu byl získán dimethyl ester 66. Následná bazická hydrolýza hydroxidem draselným ve směsi voda-etanol a vhodné kyselé zpracování poskytly žádanou dikyselinu 67. Reakce esteru 66 s kyanidem draselným, hydrolýza a odchránění 20-keto skupiny vedly ke vzniku monolyseliny 70. O O O O HO (MeOOC)2HC 66 (HOOC)2HC 67 H 63 H H O HOOCH2C 70 H Obr. 5 – Syntéza látek 67 a 70. 5. Syntéza steroidních karboxylových kyselin Wadsworth-Horner- Emmons reakcí (WHE) Čtvrtá část dizertační práce byla zaměřena na přípravu steroidních karboxylových kyselin Wadsworth-Horner-Emmons reakcí. Příslušné ethyl estery byly připraveny reakcí 3- keto derivátů 71 a 72 s intermediáty generovanými z komečně dostupných WHE činidel hydridem sodným v THF za nízké teploty. Byla použita následující WHE činidla: triethyl-2- fosfonoacetát (Obr. 6), triethyl-2-fosfonopropionát (Obr. 7), triethyl-2-fosfonobutyrát (Obr. 8) a triethyl-4-fosfonokrotonát (Obr. 9). Takto připravené ethyl estery byly následně hydrolyzovány hydroxidem draselným ve směsi etanol-voda za vzniku žádaných karboxylových kyselin. Výjimkou je kyselina 98, která byla připravena kyselou hydrolýzou, jelikož ethyl ester nepodléhal bazicky katalyzované hydrolýze, pravděpodobně ze sterických důvodů. R1 R2 __ __ O O 89 5α-H H COOH 90 5α-H COOH H R1 91 5β-H H COOH O H 71, 5α-H R2 H 92 5β-H COOH H 72, 5β-H Obr. 6 – Syntéza látek 89-92. R1 R2 __ __ O O 93 5α-H CH3 COOH 94 5α-H COOH CH3 R1 95 5β-H CH3 COOH O H 71, 5α-H R2 H 96 5β-H COOH CH3 72, 5β-H Obr. 7 – Syntéza látek 93-96. O O R1 R2 __ 1 __ R 98 5α-H COOH CH2CH3 O H 71, 5α-H R2 H 72, 5β-H Obr. 8 – Syntéza látky 98. R1 R2 __ __ O O 101 5α-H H CH=CH-COOH 102 5α-H CH=CH-COOH H R1 103 5β-H H CH=CH-COOH O H 71, 5α-H R2 H 104 5β-H CH=CH-COOH H 72, 5β-H Obr. 9 – Syntéza látek 101-104. 6. Luchova redukce nasycených steroidních ketonů V poslední části mé dizertační práce jsem se zaměřila na studium podmínek vzniku alkoholů tzv. Lucheovou redukcí tetrahydridoboritanem sodným za katalýzy heptahydrátu chloridu ceritého, iodidu samaritého a bezvodého chloridu ceritého ve směsi metanol-THF. Vzniklé směsi axiálních/ekvatoriálních, psedoaxiálnách/pseudoekvatoriálních, resp. R/S 1H alkoholů byly nejprve analyzovány pomocí NMR spekter a přesný poměr izomerů byl poté určen pomocí HPLC analýzy. Výsledky byly porovnány s poměry alkoholů připravených běžnou redukcí tetrahydridoboritanem sodným. Taktéž byl studován vliv sousedních funkčních skupin na poměr vzniklých alkoholů. O R R H H H 105 O O 106, R = OH 109, R = OH 107, R = OAc 110, R = OAc 108, R = OTBDMS 111, R = OTBDMS O O O OBz O COOMe HO O H H H 112 113 114 O O O AcO AcO AcO H 115 116 40 Redukce nasycených ketonů za katalýzy Ce3+ nebo Sm3+ umožňuje změnit poměr vznikajících alkoholů. Nejvýraznější změny byly zjištěny v případě redukce 7- a 12-keto steroidů (112, 114). Velmi zajímavé výsledky byly taktéž zjištěny v případě redukce 20-ketonu (40) za katalýzy Sm3+, které jsou srovnatelné s výsledky zjištěnými při použití bezvodého chloridu ceritého. 7. Závěr V rámci dizertační práce “Syntéza neurosteroidů: modulátorů NMDA receptoru” byly připraveny série C-3 a C-7 substituovaných 5α- a 5β-pregnanových derivátů a série karboxylových kyselin 5α- a 5β-pregnan-20-onu s karboxylovou skupinou navázanou na steroid přímo v poloze 3 nebo navázanou pomocí spojovacího můstku tvořeného 1-3 uhlíkovými atomy. Tyto látky byly testovány na Oddělení buněčné neurofyziologie na Fyziologickém ústavu Akademie věd ČR. Výsledky lze shrnout do několika bodů: (i) obecně lze říci, že aktivita výše uvedených látek je řízena konfigurací na uhlíku C5. 5β-H neurosteroidy jsou spíše inhibitory NMDA receptoru, 5α-H neurosteroidy spíše potencují; (ii) vazebné místo pro steroid na NDMA receptoru pravděpodobně vyžaduje deriváty s prostorově objemnějšími substituenty; (iii) aktivita derivátu se dvěma karboxylovými skupinami (67) se výrazně nelišila od aktivity derivátu (70) s jednou karboxylovou skupinou; (iv) téměř všechny steroidní karboxylové kyseliny připravené WHE reakcí potencují odpovědi NMDA receptoru, výjimkou jsou kyseliny 95, 96 a 98. Vysvětlit nejednotné výsledky aktivit této skupiny látek, především však zajímavou aktivitu látky 104 bude vyžadovat další výzkum. References / Seznam citací 1. Petrovic M., Sedlacek M., Horak M., Chodounska H., Vyklicky L. Jr.: 20-Oxo-5β- pregnane-3α-yl Sulfate Is a Use Dependent NMDA Receptor inhibitor. J. Neurosci. 2005,25,8439-8450. 2. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S. F.: The Glutamate Receptor Ion Channels. Pharmacol. Rev. 1999,51,7-61. 3. Miller S., Kesslak J. P., Romano C., Cotman C. W.: Roles of metabotropic glutamate receptors in brain plasticity and pathology. Ann. N Y Acad. Sci. 1995,757,460-474. 4. Doble A.: The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacol. Ther. 1999,81,163-221. 5. Sattler R., Tymianski M.: Molecular mechanisms of calcium-dependent excitotoxicity. J. Mol. Med. 2000,78,3-13. 6. Sattler R., Tymianski M.: Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Mol. Neurobiol. 2001,24,107-129. 7. Baulieu E. E.: Neurosteroids: A novel function of the brain. Psychoneuroendocrinology 1998,23,963-87. 8. Horak M., Vlcek K., Chodounska H., Vyklicky L.: Subtype-dependence of N-methyl-D- aspartate receptor modulation by pregnenolone sulfate. Neuroscience 2006,137,93-102. 9. Malayev A., Gibbs T. T., Farbs D. H.: Inhibition of NMDA response by pregnenolone sulphate reveals subtype selectivive modulation of NDMA receptors by sulphated steroids. Br. J. Pharmacol. 2002,135,901-909. 10. Park-Chung M., Wu F. S., Purdy R. H., Malayev A. A., Gibbs T. T., Farb D. H.: Distinct sites for inverse modulation of N-methyl-D-aspartate receptors by sulfated steroids. Mol. Pharmacol. 1997,52,1113-1123. 11. Irwin R. P., Lin S. Z., Rogawski M. A., Purdy R. H., Paul S. M.: Steroid Potentiation and Inhibition of N-Methyl-D-Aspartate Receptor-Mediated Intracellular Ca++ Responses: Structure-Activity Studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994,271,677-682. 12. Weaver C. E., Land M. B., Purdy R. H., Richards K. G., Gibbs T. T., Farb D. H.: Geometry and charge determine pharmacological effects of steroids on N-methyl-D-aspartate receptor-induced Ca2+ accumulation and cell death. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000,293,747- 754.
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Organic and Nuclear Chemistry Karlova Universita v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra organické chemie a jaderné chemie Mgr. Eva Šťastná Synthesis of Neurosteroids: Modulators of NMDA receptor Syntéza neurosteroidů: modulátorů NMDA receptoru PhD. Thesis Abstract Autoreferát disetační práce Praha 2009 Prague, 2009 Scientific Presentations and Posters Papers • Šťastná E.: Diazomethane (CH2N2). Synlett, 2007,15,2454. • Stastna E., Chodounska H., Pouzar V., Kapras V., Borovska J, Cais O., L Vyklicky L.: Synthesis of C3, C5, and C7 pregnane derivatives and their effect on NMDA receptor responses in cultured rat hippocampal neurons. Steroids 2009, 74, 256-263. • Kapras V., Šťastná E., Chodounská H., Pouzar V., Krištofíková Z.: Preparation of steroid sulfamates and their interaction with GABAA receptor. Coll. Czech. Chem. Comm., submitted, manuscript number CCCC/2008/000187. • Eignerová B., Slavíková B., Buděšínský M., Stastna E., Kotora M.: Synthesis of Fluorinated Brassinosteroids Based on Alkane Cross-Metathesis and Preliminary Biological Assessment. J. Org. Chem., under revision, manuscript number jo-2009- 002079. Patents • Stastna E., Chodounska H., Cais O., Vyklicky L., Kapras V., Pouzar V., Kohout L.: Steroidní anionické sloučeniny, způsob jejich výroby a jejich použití. Pregnane anionic compounds, the methods of production and their use. Filed 10th July 2008. CZ PV 2008-434. Presentations • Šťastná Eva, Pouzar Vladimír, Chodounská Hana: Stability of 7-OH epimers of 3β-hydroxy-5-en steroids. Conference of the Czech Chemical Society 2003. Nymburk, Czech Republic. Chemické listy 2003,97,1128. Awarded „One of the best student lecture of the conference“. • Eva Šťastná, Hanna Chodounská: Synthesis and hydrophilic derivatization of 3α,7α- dihydroxy-5β-pregnan-20-one. Chemické listy 2005,99,870. • Hana Chodounská, Jiří Urban, Eva Šťastná, Miloš Buděšínský: Synthesis and hydrophilic derivatization of 3α,7α-dihydroxy-5β-pregnan-20-one. XXI Conference on Isoprenoids. Bialystok-Bialowieza, Poland, 23-29 September 2005. Book of Abstracts, p. 71. Awarded: “One of the five best student lectures without sequence assessment.” • Eva Šťastná and Hana Chodounská: Utilization of vinyl nonaflates and vinyl triflates in palladium catalysed alkoxycarbonylation. VII Meeting of young researches in Biology, Biochemistry and Chemistry. Devět Skal, Czech Republic, 12-16 June 2007. Chemické listy 2007, 101, p. 458. Posters • Hana Chodounská, Jiří Urban, Eva Šťastná, Miloš Buděšínský: Synthesis of 3-carboxy derivatives of 5β-pregnan-20-one. Conference of the Czech Chemical Society 2004. Nymburk, Czech Republic. Chemické listy 2004,98,1047. • Hana Chodounská, Jiří Urban, Eva Šťastná, Miloš Buděšínský: Synthesis of 3-carboxy derivatives of 5β-pregnan-20-one. XXI Conference on Isoprenoids. Bialystok-Bialowieza, Poland, 23-29 September 2005. Book of Abstracts, p.62. • Eva Šťastná and Hana Chodounská: 3α,7α-Dihydroxy-5β-pregnan-20-one and 3α,7α- dihydroxy-5α-pregnan-20-one: Synthesis and hydrophilic derivatization. VI Meeting of young researches in Chemistry, Biochemistry, Molecular Biology. Devět Skal, Czech Republic, 14-17 June 2006. Chemické listy 2006,100,407. • Eva Šťastná and Hana Chodounská: Utilization of vinyl nonaflates and vinyl triflates in palladium catalysed alkoxycarbonylation. XVI Simposio Nacional de Quimica Organica XVI Sinaqo. Mar del Plata, Argentina, 11-14 November, 2007. Book of Abstracts, p. SO 40. • Černý I., Šťastná E., Pouzar V., Chodounská H.: Selectivity in reductions of 7-ketosteroids with sodium borohydride. Pokroky v organické, bioorganické a farmaceutické chemii – “Liblice 2008”. Chemické listy, 2008,102,1030. Curriculum vitae General Information Name: Eva Šťastná Born: on November 28, 1980 in Ostrava (Czech Republic) Nationality: Czech Contact Address: Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic Email: stastna@uochb.cas.cz Education 1999-2004 Mgr. degree in organic chemistry at Charles University in Prague, Faculty of Science. The Diploma work was done at the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic under supervision of RNDr. Hana Chodounská CSc.: Synthesis and stability of derivatives of 7-hydroxydehydroepiandrosterone Since Sept. 2004 PhD. course in Organic Chemistry, at the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic under supervision of RNDr. Hana Chodounská CSc.: Synthesis of Neurosteroids: Modulators of NMDA receptor 1. Introduction NMDA receptors (N-methyl-D-aspartate) are ligand-gated ion channels permeable to calcium and play a critical role in excitatory synaptic transmission and synaptic plasticity1. They possess distinct binding sites for exogenous and endogenous ligands. These include binding sites for the agonist L-glutamic acid, co-agonist glycine, open channel blockers, polyamines, and also neurosteroids2. L-glutamic acid (glutamate) is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system. However, under many pathological conditions the extracellular glutamate concentrations may result in over-excitation, which could induce irreversible processes in neurons including cell death - excitotoxicity3-6. Neurosteroids are compounds synthesized in the nervous tissue from cholesterol and/or from circulating precursors subsequently modified to neuroactive compounds7. Without a doubt, a lot of aspects can influence the nature and extent of the neurosteroid modulation. One of them is a chemical structure of neurosteroid. The most important results of structure-activity relationship studies can be summarized as follows10-12: • 20-Oxo-pregn-5-en-3β-yl sulfate (PS), an endogenously occurring neurosteroid, acts as a combined positive and negative modulator of NMDA receptors8,9. Nevertheless, the sulfate group is not essential for potentiation of the NMDA response, but a negatively charged group at C-3 is required for activity. • The hook shaped steroid structures associated with 5β-stereochemistry favors receptor inhibition; whereas the more planar ring structure of 5a-pregnanes favors potentiation of NMDA receptors. • The addition of a ketone group at C-7 or C-11 results in complete loss of activity, whereas 11β-hydroxy-PS is weak inhibitor. • Compounds with modifications to the C-17 side chain, such as 20β-hydroxy- PS and 21-acetoxy-PS, still potentiate the NMDA response. Removal of the ring D side chain, as in dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), markedly attenuated activity. • 17-Hydroxy-PS, which differs from PS by the presence of a hydroxyl group at C-17, has activity similar to that of PS. Structure-activity studies on NDMARs which could allow defining a binding site of neurosteroids on NMDARs could facilitate the creation of concept of a molecular template for design and development of novel therapeutic entities. 2. Synthesis of C-3 and C-7 Substituted Pregnane Derivatives The first part of the Thesis was focused on the synthesis of C-3 and C-7 substituted 5α- and 5β-pregnan-20-one derivatives (Scheme 2 and 3). In both series, three common methodologies were used to prepare desired products. Firstly, starting compounds 4 and 16 (Scheme 1) were treated with succinic anhydride in pyridine under catalysis of 4-dimethylaminopyridine to give desired hemisuccinates 5 and 17 in good yields. Secondly, starting compounds 4 and 16 were treated with sulfur trioxide pyridine complex in chloroform to afford pyridinium salts of sulfates 6 and 18. And finally, starting compounds 4 and 16 were converted to derivatives 11 and 23 by a sequence of reactions: protection of 3-hydroxy group with tert-butyldimethylsilyl group, hydrolysis of 7-acetoxy group, followed by reaction of free 7-hydroxy groups with nicotinoyl chloride hydrochloride and finally, the tert-butyldimethylsilyl group was selectively cleaved to hydroxy derivative 10 and 22. Those were subsequently transformed to pyridinium salts of sulfates 11 and 23. O O HO OAc HO OAc H H 4 16 Scheme 1 – Compounds 4 and 16 O (a) O 4 or 16 HO O OAc 5, R1 = 5α-H R1 O 17, R1 = 5β-H O (b) 4 or 16 O N O S O OAc 6, R1 = 5α-H R1 1 H O 18, R = 5β-H Scheme 2 - Synthesis of compounds 5, 17 and 6, 18. Reaction conditions: (a) Succinic anhydride, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, 140 °C; (b) sulfur trioxide pyridine complex, CHCl3. O O (a) (b) 4 or 16 TBDMSO OAc TBDMSO OH R1 1 R1 7, R = 5α-H 8, R1 = 5α-H 19, R1 = 5β-H 1 20, R = 5β-H O O (c) (f) O O O R2O N O S O R1 O R1 O H O N N 1 2 9, R = 5α-H, R = TBDMS (d 1 2 11, R1 = 5α-H 10, R = 5α-H, R = H 1 23, R = 5β-H 21, R1 = 5β-H, R2 = TBDMS (e) 1 2 22, R = 5β-H, R = H Scheme 3 - Synthesis of compounds 7-11 and 19-23. Reaction conditions: (a) tert-butyldimethylsilyl chloride, imidazole, DMF; (b) KOH, EtOH, benzene, 60 °C; (c) nicotinoyl chloride hydrochloride, 4-dimethylaminopyridine, pyridine; (d) p-toluenesulfonic acid monohydrate, MeOH, rt; (e) tetrabutylammonium fluoride, THF, rt; (f) sulfur trioxide pyridine complex, CHCl3. 3. Synthesis of 3-Steroid Carboxylic Acids The second part of the Thesis was focused on the synthesis of 3-steroid carboxylic acids utilizing palladium catalyzed alkoxycarbonylation of steroid triflates and nonaflates (Scheme 4). A methodology was firstly examined on cholestane and protected pregnane derivatives. Then, the methodology was utilized on 5α- and 5β-pregnane skeletons (44 and 46): 3-keto group was converted to enoltriflates or enolnonaflates which undergo the palladium catalyzed alkoxycarbonylation with carbon monoxide in methanol and DMF to afford unsaturated methyl esters. Catalytic hydrogenation on palladium catalyst followed by basic hydrolysis gave desired carboxylic acids (60-62). O O O R1 O H R2 H R1 R2 __ __ 44, 5α-H 60 5α-H H COOH 46, 5β-H 61 5β-H COOH H 62 5β-H H COOH Scheme 4 – Synthesis of Compounds 60-62. 4. Synthesis of 2-(Steroid-3-yl)propandioic Acid and 2-(Steroid-3- yl)acetic Acid The third part of the Thesis was focused on the synthesis of compounds 67 and 70 (Scheme 5): 3-hydroxy group of the starting material 63 was converted to tosylate, 20-keto group was protected as acetal, and finally SN2 reaction with sodium salt of dimethyl malonate gave methyl ester of dicarboxylic acid 66. Basic hydrolysis and deprotection of 20-acetal group afforded diacid 67 and decarbethoxylation followed by basic hydrolysis and deprotection of 20-acetal gave monoacid 70. O O O O HO (MeOOC)2HC 66 (HOOC)2HC 67 H 63 H H O HOOCH2C 70 H Scheme 5 - Synthesis of compounds 67 and 70. 5. Synthesis of Steroid Carboxylic Acids via Wadsworth-Horner- Emmons Reaction (WHE) The fourth part of the Thesis was focused on the synthesis of carboxylic acids via Wadsworth-Horner-Emmons reaction (WHE): 3-ketones 71 and 72 were treated with intermediates prepared from commercially available triethyl 2-phosphonoacetate (Scheme 6), triethyl 2-phosphonopropionate (Scheme 7), triethyl 2-phosphonobutyrate (Scheme 8), and triethyl 4-phosphonocrotonate (Scheme 9) with NaH in THF at low temperatures to afford particular ethyl esters. Those were then treated with potassium hydroxide to give carboxylic acids except acid 98 which was prepared by acid hydrolysis, because basic hydrolysis led only to isolation of starting material. The hydrolysis did not afford probably due to steric reasons. R1 R2 __ __ O O 89 5α-H H COOH 90 5α-H COOH H R1 91 5β-H H COOH O H 71, 5α-H R2 H 92 5β-H COOH H 72, 5β-H Scheme 6 – Synthesis of compounds 89-92. R1 R2 __ __ O O 93 5α-H CH3 COOH 94 5α-H COOH CH3 R1 95 5β-H CH3 COOH O H 71, 5α-H R2 H 96 5β-H COOH CH3 72, 5β-H Scheme 7 – Synthesis of compounds 93-96. O O R1 R2 __ 1 __ R 98 5α-H COOH CH2CH3 O H 71, 5α-H R2 H 72, 5β-H Scheme 8 – Synthesis of compound 98. R1 R2 __ __ O O 101 5α-H H CH=CH-COOH 102 5α-H CH=CH-COOH H R1 103 5β-H H CH=CH-COOH O H 71, 5α-H R2 H 104 5β-H CH=CH-COOH H 72, 5β-H Scheme 9 – Synthesis of compounds 101-104. 6. Luche Reduction of Saturated Steroid Ketones The last part of the Thesis was focused on analysis of steroid alcohols prepared by sodium borohydride reduction of saturated steroids under the conditions of Luche reduction. A serie of saturated steroid ketones was reduced by sodium borohydride in a mixture of THF and methanol under the catalysis of cerium chloride heptahydrate (CeCl3·7H2O), samarium iodide, and anhydrous cerium chloride. The mixtures of alcohols were firstly analyzed by 1H NMR and then, the exact ratios were determined by HPLC analysis. The results were compared with results obtained by sodium borohydride reduction in which none catalyst was used. The influence of neighbouring substituents was also discussed. O R R H H H 105 O O 106, R = OH 109, R = OH 107, R = OAc 110, R = OAc 108, R = OTBDMS 111, R = OTBDMS O O O OBz O COOMe HO O H H H 112 113 114 O O O AcO AcO AcO H 115 116 40 The sodium borohydride reductions under catalysis of Ce3+ or Sm3+ allow changing of the ratio of axial/equatorial, pseudoaxial/psedoequatorial, and R/S alcohols. The most significant changes were observed in case of 7- and 12-ketone steroid (112, 114). Considerably promising results were also obtained in case of 20-ketone reduction (40) which Sm3+ catalyzed reduction was comparable with results obtained by anhydrous Ce3+ catalysis. 7. Conclusions Within the Thesis I have prepared a serie of C-3 and C-7 substituted pregnane derivatives and a serie of carboxylic acids of 5α- and 5β-pregnan-20-one having carboxylic group joined directly to steroid in position 3 or by spacer of 1-3 carbon atoms. These compounds were tested at the Department of Cellular Neurophysiology at the Institute of Physiology, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic. In general, the results can be summarized as follows: (i) 5β-H neurosteroids are rather inhibitors, whereas 5α-H derivatives rather potentiate; (ii) the binding site for steroids on NMDA receptor rather adopt bulky substituents; (iii) the activity of derivative with two carboxylic acids (67) did not significantly change in comparison with derivative (70) bearing only one carboxyl group; (iv) carboxylic acids prepared via WHE reaction in general potentiate, nevertheless the ambiguous results demand further investigation. 1. Úvod NMDA receptory (N-methyl-D-aspartate) jsou ligandem aktivované iontové kanály propustné pro vápenaté ionty, které hrají klíčovou roli v synaptickém přenosu a jeho plasticitě1. NMDA receptory mají odlišná vazebná místa pro exogenní a endogenní ligandy, mezi které patří vazebná místa pro agonistu – L-glutamovou kyselinu, koagonistu – glycin, dále např. Pro blokátory iontového kanálu, polyaminy a také neurosteroidy2. L-glutamová kyselina (glutamát) je hlavní excitační neurotransmiter centrální nervové soustavy. Za určitých patologický podmínek však vysoká koncentrace extracelulárního glutamátu může vést k nadměrné excitaci, jejímž důsledkem mohou být irevesibilní procesy na neuronech, které mohou vést až k buněčné smrti3-6. Literatura tento jev popisuje jako tzv. excitotoxicitu. Termín neurosteroidy označuje skupinu steroidních látek syntetizovaných v nervové tkáni z cholesterolu nebo ze steroidních prekurzorů z periferních zdrojů7. Charakteristika a míra ovlivnění NMDA receptoru neurosteroidem závisí na mnoha faktorech. Jedním z nich je chemická struktura steroidu. Následující body shrnují současné poznatky strukturně aktivitních studií vlivu steroidů na NMDA receptory 10-12: • 20-Oxo-pregn-5-en-3β-yl sulfát (PS), endogenní neurosteroid, působí jako positivní i negativní modulátor NMDA receptoru8,9. Sulfátová skupina může být nahrazena jiným, negativně nabitým substituentem v poloze C-3 . • Neurosteroidy s konfigurací 5β-H jsou spíše inhibitory, 5α-H neurosteroidy spíše potencují odpověď NMDA receptoru. • 11β-hydroxy-PS je slabý inhibitor, zatímco přítomnost keto skupiny v poloze C-7 nebo C-11 vede ke kompletní ztrátě aktivity. • Sloučeniny s modifikací 17β-postranního řetězce jako např. 20β-hydroxy-PS a 21-acetoxy-PS potencují odpověď NMDA receptoru. Odtranění postranního řetězce, jako např. 17-oxo-androst-5-en-3β-yl sulfátu (DHEAS), výrazně snížilo aktivitu. • 17-Hydroxy-PS, který se liší of PS přítomností α-hydroxylové skupiny v poloze C-17, má srovnatelnou aktivitu s PS. Studium vztahů mezi strukturou a aktivitou neuroaktivních steroidů na NMDA receptorech by mohlo vést k nalezení vazebného místa, a tak usnadnit vytvoření konceptu molekulárního templátu pro vývoj nových terapeutických prostředků k medikaci chorob spojených s excitotoxicitou. 2. Syntéza C-3 a C-7 substituovaných pregnanových derivátů V první části dizertační práce byla zaměřena na přípravu C-3 a C-7 substituovaných 5α- a 5β-pregnanových derivátů (Obr. 2 a 3). Byly použity tři základní reakční sekvence pro přípravu žádaných derivátů. Hemisukcináty 5 a 17 byly připraveny reakcí výchozích látek 4 a 16 (Obr. 1) s anhydridem kyseliny jantarové a 4-dimethylaminopyridinem a pyridiniové soli sulfátů 6 a 18 reakcí s komplexem pyridin-oxid sírový. Pro přípravu derivátů 11 a 23 byla použita následující reakční sekvence: 3-hydroxy skupiny byly nejprve ochráněny jako tert-butyldimetylsilyl deriváty (TBDMS), 7-acetátové skupiny byly hydrolyzovány, aby posléze byly takto připravené volné 7-hydroxy skupiny ochráněny reakcí s nikotinoyl chloridem hydrochloridem. Volné 3-hydroxylové skupiny, které vznikly štepením chráněných TBDMS derivátů, byly převedeny na pyridiniové soli sulfátů 11 a 23. O O HO OAc HO OAc H H 4 16 Obr. 1 – Látky 4 a 16 O (a) O 4 or 16 HO 5, R1 = 5α-H O OAc R1 O 17, R1 = 5β-H O (b) 4 or 16 O N O S O OAc 6, R1 = 5α-H R1 1 H O 18, R = 5β-H Obr. 2 – Syntéza látek 5, 17 a 6, 18. Reakční podmínky: (a) anhydrid kyseliny jantarové, pyridin, 4-dimethylaminopyridin, 140 °C; (b) komplex pyridin-oxid sírový, CHCl3. O O (a) (b) 4 or 16 TBDMSO OAc TBDMSO OH R1 1 R1 7, R = 5α-H 8, R1 = 5α-H 19, R1 = 5β-H 1 20, R = 5β-H O O (c) (f) O O O R2O 1 N O S O 1 R O R O H O N N 1 2 9, R = 5α-H, R = TBDMS (d 1 2 11, R1 = 5α-H 10, R = 5α-H, R = H 1 23, R = 5β-H 21, R1 = 5β-H, R2 = TBDMS (e) 1 2 22, R = 5β-H, R = H Obr. 3 – Syntéza látek 7-11 a 19-23. Reakční podmínky: (a) tert-butyldimethylsilyl chlorid, imidazol, DMF; (b) KOH, EtOH, benzen, 60 °C; (c) nikotinoyl chlorid hydrochlorid, 4-dimethylaminopyridin, pyridin; (d) monohydrát kyseliny p-toluensulfonové, MeOH, rt; (e) tetrabutylammonium fluorid, THF, rt; (f) komplex pyridin-oxid sírový, CHCl3. 3. Syntéza 3-steroidních karboxylových kyselin Druhá část dizertační práce byla zaměřena na přípravu 3-steroidních karboxylových kyselin pomocí palladiem katalyzované alkoxykarbonylace triflátů a nonaflátů (Obr. 4). Zvolená metodika byla nejprve vyzkoušena na cholestanovém a vhodně chráněném pregnanovém derivátu. Poté byla použita pro syntézu 3-karboxylových kyselin 5α- a 5β- pregnanových derivátů 44 a 46: 3-keto skupina byla transformována na směs enol triflátů a enol nonaflátů, které jsou velmi dobrou odstupující skupinou pro palladiem katalyzovanou alkoxykarbonylaci oxidem uhelnatým ve směsi metanol-DMF. Takto připravené nenasycené methyl estery byly katalytickou hydrogenací a posléze bazickou hydrolýzou převedeny na požadované karboxylové kyseliny (60-62). O O O R1 O H R2 H R1 R2 __ __ 44, 5α-H 60 5α-H H COOH 46, 5β-H 61 5β-H COOH H 62 5β-H H COOH Obr. 4 – Syntéza látek 60-62. 4. Syntéza 2-(steroid-3-yl)propandiové kyseliny a 2-(steroid-3- yl)octové kyseliny Třetí část dizertační práce byla zaměřena na přípravu dikarboxylové kyseliny 67 a kyseliny 70 (Obr. 5). Nejprve byla 3-hydroxylová skupina výchozí látky 63 ochráněna jako tosylát a 20-keto skupina jako acetal. Reakcí takto připraveného ochráněného derivátu se sodnou solí dimethyl-malonátu za refluxu v toluenu byl získán dimethyl ester 66. Následná bazická hydrolýza hydroxidem draselným ve směsi voda-etanol a vhodné kyselé zpracování poskytly žádanou dikyselinu 67. Reakce esteru 66 s kyanidem draselným, hydrolýza a odchránění 20-keto skupiny vedly ke vzniku monolyseliny 70. O O O O HO (MeOOC)2HC 66 (HOOC)2HC 67 H 63 H H O HOOCH2C 70 H Obr. 5 – Syntéza látek 67 a 70. 5. Syntéza steroidních karboxylových kyselin Wadsworth-Horner- Emmons reakcí (WHE) Čtvrtá část dizertační práce byla zaměřena na přípravu steroidních karboxylových kyselin Wadsworth-Horner-Emmons reakcí. Příslušné ethyl estery byly připraveny reakcí 3- keto derivátů 71 a 72 s intermediáty generovanými z komečně dostupných WHE činidel hydridem sodným v THF za nízké teploty. Byla použita následující WHE činidla: triethyl-2- fosfonoacetát (Obr. 6), triethyl-2-fosfonopropionát (Obr. 7), triethyl-2-fosfonobutyrát (Obr. 8) a triethyl-4-fosfonokrotonát (Obr. 9). Takto připravené ethyl estery byly následně hydrolyzovány hydroxidem draselným ve směsi etanol-voda za vzniku žádaných karboxylových kyselin. Výjimkou je kyselina 98, která byla připravena kyselou hydrolýzou, jelikož ethyl ester nepodléhal bazicky katalyzované hydrolýze, pravděpodobně ze sterických důvodů. R1 R2 __ __ O O 89 5α-H H COOH 90 5α-H COOH H R1 91 5β-H H COOH O H 71, 5α-H R2 H 92 5β-H COOH H 72, 5β-H Obr. 6 – Syntéza látek 89-92. R1 R2 __ __ O O 93 5α-H CH3 COOH 94 5α-H COOH CH3 R1 95 5β-H CH3 COOH O H 71, 5α-H R2 H 96 5β-H COOH CH3 72, 5β-H Obr. 7 – Syntéza látek 93-96. O O R1 R2 __ 1 __ R 98 5α-H COOH CH2CH3 O H 71, 5α-H R2 H 72, 5β-H Obr. 8 – Syntéza látky 98. R1 R2 __ __ O O 101 5α-H H CH=CH-COOH 102 5α-H CH=CH-COOH H R1 103 5β-H H CH=CH-COOH O H 71, 5α-H R2 H 104 5β-H CH=CH-COOH H 72, 5β-H Obr. 9 – Syntéza látek 101-104. 6. Luchova redukce nasycených steroidních ketonů V poslední části mé dizertační práce jsem se zaměřila na studium podmínek vzniku alkoholů tzv. Lucheovou redukcí tetrahydridoboritanem sodným za katalýzy heptahydrátu chloridu ceritého, iodidu samaritého a bezvodého chloridu ceritého ve směsi metanol-THF. Vzniklé směsi axiálních/ekvatoriálních, psedoaxiálnách/pseudoekvatoriálních, resp. R/S 1H alkoholů byly nejprve analyzovány pomocí NMR spekter a přesný poměr izomerů byl poté určen pomocí HPLC analýzy. Výsledky byly porovnány s poměry alkoholů připravených běžnou redukcí tetrahydridoboritanem sodným. Taktéž byl studován vliv sousedních funkčních skupin na poměr vzniklých alkoholů. O R R H H H 105 O O 106, R = OH 109, R = OH 107, R = OAc 110, R = OAc 108, R = OTBDMS 111, R = OTBDMS O O O OBz O COOMe HO O H H H 112 113 114 O O O AcO AcO AcO H 115 116 40 Redukce nasycených ketonů za katalýzy Ce3+ nebo Sm3+ umožňuje změnit poměr vznikajících alkoholů. Nejvýraznější změny byly zjištěny v případě redukce 7- a 12-keto steroidů (112, 114). Velmi zajímavé výsledky byly taktéž zjištěny v případě redukce 20-ketonu (40) za katalýzy Sm3+, které jsou srovnatelné s výsledky zjištěnými při použití bezvodého chloridu ceritého. 7. Závěr V rámci dizertační práce “Syntéza neurosteroidů: modulátorů NMDA receptoru” byly připraveny série C-3 a C-7 substituovaných 5α- a 5β-pregnanových derivátů a série karboxylových kyselin 5α- a 5β-pregnan-20-onu s karboxylovou skupinou navázanou na steroid přímo v poloze 3 nebo navázanou pomocí spojovacího můstku tvořeného 1-3 uhlíkovými atomy. Tyto látky byly testovány na Oddělení buněčné neurofyziologie na Fyziologickém ústavu Akademie věd ČR. Výsledky lze shrnout do několika bodů: (i) obecně lze říci, že aktivita výše uvedených látek je řízena konfigurací na uhlíku C5. 5β-H neurosteroidy jsou spíše inhibitory NMDA receptoru, 5α-H neurosteroidy spíše potencují; (ii) vazebné místo pro steroid na NDMA receptoru pravděpodobně vyžaduje deriváty s prostorově objemnějšími substituenty; (iii) aktivita derivátu se dvěma karboxylovými skupinami (67) se výrazně nelišila od aktivity derivátu (70) s jednou karboxylovou skupinou; (iv) téměř všechny steroidní karboxylové kyseliny připravené WHE reakcí potencují odpovědi NMDA receptoru, výjimkou jsou kyseliny 95, 96 a 98. Vysvětlit nejednotné výsledky aktivit této skupiny látek, především však zajímavou aktivitu látky 104 bude vyžadovat další výzkum. References / Seznam citací 1. Petrovic M., Sedlacek M., Horak M., Chodounska H., Vyklicky L. Jr.: 20-Oxo-5β- pregnane-3α-yl Sulfate Is a Use Dependent NMDA Receptor inhibitor. J. Neurosci. 2005,25,8439-8450. 2. Dingledine R., Borges K., Bowie D., Traynelis S. F.: The Glutamate Receptor Ion Channels. Pharmacol. Rev. 1999,51,7-61. 3. Miller S., Kesslak J. P., Romano C., Cotman C. W.: Roles of metabotropic glutamate receptors in brain plasticity and pathology. Ann. N Y Acad. Sci. 1995,757,460-474. 4. Doble A.: The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacol. Ther. 1999,81,163-221. 5. Sattler R., Tymianski M.: Molecular mechanisms of calcium-dependent excitotoxicity. J. Mol. Med. 2000,78,3-13. 6. Sattler R., Tymianski M.: Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Mol. Neurobiol. 2001,24,107-129. 7. Baulieu E. E.: Neurosteroids: A novel function of the brain. Psychoneuroendocrinology 1998,23,963-87. 8. Horak M., Vlcek K., Chodounska H., Vyklicky L.: Subtype-dependence of N-methyl-D- aspartate receptor modulation by pregnenolone sulfate. Neuroscience 2006,137,93-102. 9. Malayev A., Gibbs T. T., Farbs D. H.: Inhibition of NMDA response by pregnenolone sulphate reveals subtype selectivive modulation of NDMA receptors by sulphated steroids. Br. J. Pharmacol. 2002,135,901-909. 10. Park-Chung M., Wu F. S., Purdy R. H., Malayev A. A., Gibbs T. T., Farb D. H.: Distinct sites for inverse modulation of N-methyl-D-aspartate receptors by sulfated steroids. Mol. Pharmacol. 1997,52,1113-1123. 11. Irwin R. P., Lin S. Z., Rogawski M. A., Purdy R. H., Paul S. M.: Steroid Potentiation and Inhibition of N-Methyl-D-Aspartate Receptor-Mediated Intracellular Ca++ Responses: Structure-Activity Studies. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994,271,677-682. 12. Weaver C. E., Land M. B., Purdy R. H., Richards K. G., Gibbs T. T., Farb D. H.: Geometry and charge determine pharmacological effects of steroids on N-methyl-D-aspartate receptor-induced Ca2+ accumulation and cell death. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000,293,747- 754.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Eva Šťastná, Ph.D. 1.21 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Eva Šťastná, Ph.D. 353 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Eva Šťastná, Ph.D. 353 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. RNDr. Eva Klinotová, CSc. 1.11 MB
Stáhnout Posudek oponenta Prof. RNDr. Pavel Drašar, DSc. 130 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Richard Hampl, DrSc. 100 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 236 kB