velikost textu

Úloha proteinů CIDE při apoptóze a morfologie mitochondriální sítě v patogeneze

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Úloha proteinů CIDE při apoptóze a morfologie mitochondriální sítě v patogeneze
Název v angličtině:
The role of CIDE proteins in apoptosis and mitochondrial network morphology under pathogenetic conditions
Typ:
Disertační práce
Autor:
Jitka Špačková
Školitel:
RNDr. Petr Ježek, DrSc.
Oponenti:
Ing. Jan Teisinger, CSc.
doc. RNDr. Martin Kalous, CSc.
Id práce:
112813
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyziol. živočichů a vývoj. biol. (zrušena) (31-150)
Program studia:
Biologie (P1501)
Obor studia:
Fyziologie živočichů (XFYZZ)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
16. 12. 2008
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Souhrn CIDEa (Cell death-inducing je effector.a) protein, ktenýmuže factor].like DFFIDNA fiagmentation iniciovat apoptózu skze narušení proteinu DFF, sloŽeného nukleáay DFF40, heterodimeríckého z kterou aldivuje kaspáza3 a jejiho inhibitoru DFF45. Měřili jsme hladiny mRNA CiDEa v tkáních laboratorníhopotkana a detekovalj tento protein ve lysohých hladinách v bílé tukové tkani. Potvrdili jsme také přítomnost proteinu CIDEa v mrtochondriícha důležitost jeho CIDE-C doménypro tuto lokalizaci. Ukiízalo se, že mýšená exprese proteinu CIDEa vedla kapoptóze' Dále jsme provedli imunodetekci buněčnýchfrakcí HeLa buněk upravených na tetracyklinem indukovanou expresi. Po inkubací s campthotecinem nebo valinomycinem jsme s]edovali redistribuci proteinu CIDEa do jádra. Předpokládáme,že CIDEa se nacházív mitochondriícha její transportdojádra může zesílitnebo iniciovat mechanismusapoptóZy' Mitochondrie tvoří v buňkách retikularni struktury,které kontinuálně procháaejí procesy fúzea fragnentace. Doposud provedenétrojrozměméanalýzy mítochondriíale nepopsaly detaílně jejich strukturu' Analyzovali jsme mitochondriální síť u buněčnýchlinii INSIE a }iEPG2 traďekovaných mitochondriálněadresovaným GFP. Pomocí 4Pi mikoskopie se mohou sledovat přesné změny v 3D struktuře, odpovídající změnám energetických stavův buňkách' a to při podmínelr' rozlišeníl00nm. Mitochondrie INSlE buněk za normálníchkultívačních tedy v médiu s l l mM glukózou měly hustou mrtochondriálnísíťs tenloýmiVětvenými tubuly' kterétvořily jedno propojené retikulum o průměrufib:u|tt262+26 m' U buněk kultivovaných v nízké5mM glukóze buňky změnily svůj war z typického protahlého spíšeoválný a jejich tubuly byly na silnější,vpruměru 3ll+36 m' Podobně, mítochondriebuněk }1EPG2, rostoucíchvoptimálním médiu s glukózou o koncentraci 5mM nebo v hyperglykemíckýchpodmínkách,měly propojené retikulum a průměr tubulů 284+38m a 4l7+l10 m. Při inhibované respiraci, indukované -300 rotenonemdošlok rozpadu mitochondriálnísítěna několik hlavníchčtístí mnoho menších, a nm fubulů koulí.Po odpřaženíindukovanémFCCP se navíc formovaly prstencovéútvary o a průměru700 aŽ2000 nm. Po inkubaci s odpřahovačem rotenonemse projevil většípoměr fuze i k fragmentacineŽ v předchozímpřípaděa utvořily se miskovitéútvaryo velikostí 0'7 až 2 pm. Doplnili jsme tedy dříve nepopsané detaily tvaru mítochondriální při její desintegracia jasně sítě ukina|i, žeje lrysoké rozlišení mikroskopie nezbytné detailnípopis mitochondrií. 3D 4Pi pro
Abstract v angličtině:
Summary Cď deďh-indrcing DFFIDNA fragmentationfactor]-like effector-a (CIDEa)' may initiďe 4optosis by disrupting a complex consisting of 40-kDa caspase-3-aďvďed nuclease DFF40 md its 45.kDa inhibitor DFF45. We measured Íhe levels of mRNA CIDEa in rattus norvegicus tissues and deteďed high lwels of RNA in white aďpose tiszue. We have confirmed the presenceof CIDEa in mitoohon&ia and importanceof CIDE-C domain for this localization. We have also performed immrrnodetection subcellular &actions ofHela cells of adapted for a tetracycline-inducible CIDEa expression. We have observed redistribution, enhancedupon treatuotrt with camptothecin or valinomycin, of CIDEa to nucleus. CIDEa contentincreasď in the nuclear fraction but decreasedin oýosolio fraction in cells heated to initiaÍe4optosis. We hypothesize that CIDEa is sequestered mitochondria while transfer of in this pote,ntiallydangerousprotein from mitochondria into nucleus intensifies or even initiates apoptosis. Mitochondria in nrrmerouscell types, especiďly in cultured cells, form a reticula network undergoing constant fusion and fission. The tbree dimensionď (3D) morphology of these networks however has not been stuďed in detail to our knowledge. We have investigated insďinoma INS-IE and hepatocellular oarcinoma HEP-G2 cells hansGoted \Yith mitoohondria-addressed GFP. Using 4Pi microscopy, 3D morphology changesresponding to deqeased oxidative phosphorylation anďor energetic stafus could be observed in these cells at an unprecedented100 nm level ofdetail. In INS-IE oolls oultivated at I I mM gluoose,the mitoreticulum rypean predominantly as one interconnected mitochondrion with a nearly constant 262*26 nm tubule diameter' When oútued ď 5 mM glucose' INS-IE cells show 3ll+36 nm tubules coexisting with numerous flat cisteNnae. Similr interconneoteÁ2&A+38 nm and 417+ll0 nm tubules were found in řIEP-G2 cells cultivated ď 5 mM md h1perglycemic 25 mM glucose, respeďvely' With rotenone inhibiting respiration to -|0o/o, ďsintegration into several reticula and nrrmrous -300 nm spheres or short tubules was observed. Deenerýation by uncoupling adďtíonally led to formation of rings and bulky cistemaeof 1.4+0.4pn dimeter. Rotenone and uncoupler acted syrergically in INS-IE cetls and increasedfusion (ongoing with fission) forming bowl-like shapes.Thus we have reveďed previouďy undescribed details for shapes upon mitochondriď disintegration and clearly demonstated that higb resolution 3D mioroscopy is required for visualizďion of the mitochondriď network
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Jitka Špačková 2.54 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Jitka Špačková 500 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Jitka Špačková 499 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jan Teisinger, CSc. 1.22 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Martin Kalous, CSc. 1.72 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 468 kB