velikost textu

Uncoupling of DNA restriction and DNA translocation functions of the Type I restriction modification enzyme EcoR124I

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Uncoupling of DNA restriction and DNA translocation functions of the Type I restriction modification enzyme EcoR124I
Název v češtině:
Oddelenie restrikčnej a translokačnej funkcie rastrikčne modifikačného enzyme Typu 1 EcoR1241
Typ:
Disertační práce
Autor:
Ing. Eva Šišáková, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Marie Weiserová, CSc.
Oponenti:
RNDr. Jiří Janeček, CSc.
Dr. Pavel Janščák, Ph.D.
Id práce:
112716
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie (P1515)
Obor studia:
Molekulární a buněčná biologie (XMOL)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
20. 4. 2009
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
4 Lívery sme pripravili kolekciu Ínutantovsjednou substitrlciou l. Miestne cielenou mutagerÉzou konzervovaných aminokyselinových zvyškov v motívoch II a III v N.Íerminálnej ónÉne podjednotky HsdR enzymuEcoRl24I:Dl5lA, El65A, El65D, EI65II adK167A. r Pozitívnym a negativnym komplementďným tostonr ilr ylvo sme zistili' Že všet$ mutantyprejavili fenoýp ťď. r Test restrikcie DNA ',? vjrro potvrdil výsledky in vivo testov, Že Žiadny z mutantov plazmidovú nebol schopníštiepiť DNA na lineá'muforrnu. r Test viizbovosti DNA (EMSA) neodhalil žiadne významrÉ rozďely medzi divolcým a mutantnýmienzýmamiv schopnostiviazaťDNA. r Metóda na meranieATPázovej aktivity, zaloŽeruí použití na proteínu viaŽúcehg fosfáL ukázalu Že substitucie v motíve II a Itr u váčšinymutantov spÓsobila virc než2. redukciu hydrolýzy ATP. Mutant Kl67A bol jeďný' ktoý prejavil aktivifu nrásobnú porovnatelhúdivolcým s enzýmom. r proces bol analyzovanýdisociáciou triplexu na stopped.fbw fluorimetri Translokačný a pornocoumagnetickejpinzeý. obe techniky ukázali zntžené translokďné rýchloati mutantov, rozdiely medzi mutantamia divohým enzýmom boli ešteýraznejšie pri merani na magrretickej pinzete. Pozorovali sme takztiez zmenerrú procesivih1iniciáciu a bimoďílnudistribúciu ýchlostí. Rl 2. Aminokyselinovézvyšlry Q a Y v motíveQxxxY podjednotkyHsdR boli substituované miestnecielenoumutagenézoq pričom boli vývorenénasledovné mutaltyl Q.l79A' Ql79K' Yl83A' Yl83F advojiý mutantQl79A'Yl83A. o EMSA llkáza|a,Že všetkymutácie destabilizovaliviizbu & komplexu,pričom najváčší efekt bol pozorovanýu zvyšku Yl83. Dvojiý mutant (Ql79A'Yt83A) prejavil najviřšie zniŽenieď'nity k DNA. S výnimkou dvojitéhomutanfu (Q179A,Y183A), všetky ostatné mutanty ukázďi rovnaké translokačné vlastnosti ako divolcý eruým. Vzhťadom k velkej chybe v Q179A'YI83A dátach sme neboli schopníposúdiť, bol experimnetálnej či motor. tentoenzýmnajýchlejší DNA. Všetky mutácie v motíve QxxxY zmenili ýchlosť a efeldivitu štiepenia Rýchloďajhydrolýzyjednéhoajobochreťazcovbo|azruŽená,pričomváčšmibola ovpýnená hydro|ýza druhého azcu ret i I I B )
Abstract v angličtině:
v vuuuerJ Type I restriďion-modification enzyme EcoRl24I is a multifunctional, hetero.oligomeric enzyme complex that cleaves DNA after extensive ATP hydrolysis coupled to processive DNA translocation.ATP hydrolysis and DNA translocationare conferredby superfamily 2 (SF2) helicase motifs in the central domain of its HsdR subunit. The N-terminal domain carries a conserved region with catalytic residues reminiscent of the PD-@/D)xK catalytic motif of Type II restrictionenzymes. Single amino acid substitutionsin the motifs II and III reduced or removed DNA cleavage activiý of the enzyme complex without ďfecting an assemblyof the complex and its DNA- binding properties.Using a combination of bulk solution and single-molecule assays, we investigatedthe influence of these mutations on the DNA translocation properties of the enzyme, conferred by the helicase domain. Reduced ATPase activiý of the mutants was detected by steady-statestopped flow measurementswith the use of phosphate-binding protein. These results do not show a clear relationship betweenthe translocationrates and ATPase rates. Probably the broader and bimodal distribution of hanslocation rates and the stalling events during initiation revealed in single molecule experimentsall lead to a lower ATPase rates.We suggestan existenceof possible interdomďn interactionsbetween apparent the helicase and the nuclease domains of the HsdR subuď! which is inďcated by the observedeffect of thesemutationson the ATPase aďiviý and the DNA translocation. In addition to the principal PD-(E/D)XK Motifs, I, II and III, bioinformatic analysis of the HsdR subunitsof EcoRl24I revealed the presenceof a Q>o<xY motif that is characteristicfor RecB-family nucleases.The QxxxY motif resides immeďate|y C-terminally to Motif III within a region of the prediďed g-helix. We examinedtlrc role of the Q and Y residues in DNA binding, translocation and cleavage with tbe nse of site-directedmutagenesis.The mutationsin the QxxxY motif did not changeÚt DNA translocďion properties;however,ď| l of them alteredthe DNA binding ďfrniý and relred boů ŮÉrale and the effrciency of DNA t cleavage.Role(s) of the QxxxY motif in @oÍdiÉin of tb catalytic residues anďor in a stabilizationof the nucleasedomainon the DNA re dirotsd. 26
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Ing. Eva Šišáková, Ph.D. 5.16 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Ing. Eva Šišáková, Ph.D. 757 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Ing. Eva Šišáková, Ph.D. 487 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jiří Janeček, CSc. 1015 kB
Stáhnout Posudek oponenta Dr. Pavel Janščák, Ph.D. 1.59 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 667 kB