velikost textu

Improvement of retroviral vectors for efficient gene transfer

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Improvement of retroviral vectors for efficient gene transfer
Název v češtině:
Zdikonalování etrovirových vektorů pro účinný přenos genů
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Filip Šenigl, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Jiří Hejnar, CSc.
Oponenti:
RNDr. Michal Šmahel, Ph.D.
prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc.
Id práce:
112676
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie (P1515)
Obor studia:
Molekulární a buněčná biologie (XMOL)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
30. 9. 2008
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Souhrn výsledků Retrovirové vektory, kteréjsou sďropnéefektivně přenášetgenetickou informaci do cilových buněk a integrovď se do jejich DNd jsou velice užitečrré mnoho experimentri pro ďe poúý stabitnípřenos geirů ještěnemusl bý dostačující. expresi přenesenýchgenůhrají V významnou roli takéepigenetickémodifikace. Exprese muže bý přerrršena v momantě již integrace DNA vektoru nebo můžedochrázetkpostupnému vypinaní kopii vektoru během ďouhodobých experimentů.Rebovirové vektory se mohou ve stabilitě exprcse výzrramně lišit ďe posfupnému transkripčnímuumlčováni poďéhají všechny. Proto je zapotřebí mďifikovat retovirové vektory za účelem stabilizace jejich exprese v ciloých buňkóch. stabi|ní exprese je důIeátri zejmerravoblasti genovéterapie, kde je opakovrini bansdukce často nemožnénebo ve|mi komplikované. Retrovirovévektory odvozenéod ASLV jsou v savčíchbuňkách velmi účinně Testova|ijsme moŽnost stabilizovat expresi těchto vektorůinzerci vnitřního umlčovárry. elementuCpG ostrovu (IE). cpc ostrovy jsou aliímésvou schopnostiudržovatpřilehlé aktivní' Konstruova|ijsme vnitřní element CpG' ostrova genu pro promotorytranskripčně adenosinfosforibosyltransferrázu o déIce l20bp' Tento e|ement vloŽen v sensei antisense byl orientacido tří ruznýchm|stuvnitř LTR (nazačátek oblastiU3, mezi enhancery pÍomotor a a na začátekoblasti U5)' Týo vektory vykazovaly ruzrrou miru ochrany před transkripčním umlčovrinim.Nejméněstabilni byly ty vektory, kteÍé měly IE vloženna začátek LTR resp. U3. Naopak nejstabi|nější expresivykazovaly vektorys vloženimIE mezi oblastenharrcerůa promotor. po Týo vektory by|y kultivovtfuty dobu ťí měsicůanižby u nich bylo pozorováno vnazné umlčovríni Kromě toho jsme se pokusi|i v|ožitmezi enhancerya pÍomotoÍ expÍese. tandem dvou IE v antisenseorientaci a pozorova|ijsme ještě výraznější ochrarmýefekt. Takov'ývektor v1,kazovalve|icestabi|niexpresia téměř žádné umlčování běhemčtyřměsíců kultivace. Během experimentů ukázalo, Že orientace IE nehrajev'ýmamnou roli v ochraruré se funkci elementu. PouŽiý IE obsahujedvě vysoce afinni vazebnámístatranskipčního faktoruSpl. Do elementujsme zaveďi bodovémutace,kterékompletnězrušily schopnostsekvenceviizat příslušný protcin. Všechny vektory obsahujíciIE s mutovanýmiSpl misty vykazovaly ve partneryyýznamněsníženou srovnánísjejich nemutovan1imi stabilitu expreseGFP. Nďe v'ýsledky ukazují' Že vazebná mista Spl jsou důležitápro ochranou funkci IE, ale přinejmenšim tétofunkceje zachovánai v elementus mutovarr;ými část místypro vazebn1ýmí Spl. Dále jsme testovali možlost reaktivace umlčenýchvektorů působeniminhibitorů (S.azacytidin_ 5-azaC) a histondeacetylríz mety|transferáz (TrichostatinA - TSA). oba inhibitory aplikované zvlríšť byly schopné reaktivovatum|čenévektory, ale nejvýrazrrějšího kombinacíobou. Několik týdnůpo infekci bylo moálé reaktivovat efektu bylo dosaženo většinuumlčených vektoru.Možnostreaktivace všakpostupněklesďa a po čtyřech měsicich kultivace jiŽ b1{y schopnéreaktivace pove 2%ovektorů. To pravděpodobněsouvisí s násrupemdalších epigenetických mechanismů,kteréudrŽujíumlčenýstav vektoru. Dále jsme analyzovali metylačnístav vektoru a zjistili jsme, že um|čené vektoryjsou po ďouhé době od infekce masivně metylované. druhoustranustabilni modifikované Na vektory,které nepodléhaji vykazovaly pouze zanedbatelnou um|čovriní, úroveňmety|ace. Tento stavse však velice |išil od staw, kteý byl pozorovián krátce po infekci. I um|čené vektory byly méně metylovanéneŽ tytéžvektory delší dobu po infekci. Z toho vyplývri že umlčováni integrovaných proviru je spojenos metylacíCpG dínukleotidů promotorových v oblastech, nicrnéně existují další umlčovací mechanismy, které předcházeji nástupu mety|ace proviroqých LTR. v da|šíčásti projektu jsme se zaměřili na vstup ASLV virů a vektoru od nich odvozenýchdo buňky. Klíčovýmkrokem vstupuviru je vazba virovépartikulena buněčný jsme gen kódující buněčný receptor. IdentiÍikovali pro viry podskupiny C viru Íeceptor ASLV' Lokus rvc byl by| loka|izovan dřive (Ellederet a|,,2004)a my jsme testovaliklony již BAC odpovidající ob|asti'Po identifikacíklonu BAC obsahujícího identifikované lokus rvc jsme dále tento lokus identifikovali pozičnímklonoviírrím následně klonovali cDNA a kódujicí předpokládaný Tvc. Zjistili jsme, Že mRNA rvc je ďouhá l875 nukleotidů Íeceptor sjedním otevřeným čtecím rámcem kódujícím 488 aminokyselin. Předpokládaná aminokyse|inová sekvencereceptoruTvc byla použita lryhledávaní proteinové pro v databazi NCBI s použitim a|goritmu protein-proteinBLAST. Jako nejpodobnější proteiny byly nalezeny lidské a bovinni but1toýliny BTNIA1 a myši butyrofylin BTNIAI. Po zjištění sekvencemRNAjsme se zaměň|ina důkladné identifikacegenujako receptoru prověření Tvc. cDNA by|a klonoviina do expresnihoplazmidu pod kontro|oučasného promotoruSV40. Timto plazmidernjsme Íarrsfekovaliembryonání fibroblastylinie Ll5' kteráje rezistentní k infekci viry podskupiny C, a nrislednětýo buňky vystavili replikačně kompetentnímu virovémuvektoruRCASBP(C)GFP' kteý má na svémpovrchuobalový proteinviru ASLV podskupinyC a kóduje reportérov'ý GFP. Ukazalo se, žetransfekované gen buňky byly citlivé jsme dosríhli k infekci tímtovektorem'Stejnýchvýsledků transfekcí savčích buněk.Předchozi poskyt|ydostatečná potvrzujicífunkci identifikovaného jako receptoru experimenty data genu Tvc' nicméněneposkytlajasný důkaz'Že identifikovanýgen je jediným genem kódujícím funkčniTvc receptor' Proto jsme se roáodli připravit buňky, kterébudou mít tento gen jejích citlivost k infekci viry podskupinyC. odstraněn svéhogenomua nrislednětestovat ze liinie DT40 je citlivá k infekci viry podskupinyC a díky lrysoké Kuřecí buněčná frekvenci je homolognírekombinace vhodná pro cílenoudeleci genů.Genomové oblasti obklopující gen rvc v buňkách DT40 byly klonoviiny a použityk cíIené integraci a kompletnídeleci kódujicí sekven Ívc' Buněčnýk|on DT40 fvcJ. se stejnoumorfologií,Životaschopností a pro vlastnostrnibyt vybrrfur dalšítestoviiní. rusto\.ýTni buňky DT40 a DT40 tvc-/- Původní klon byly vystavenyvektoruRCASBP(C)GFP (obal podskupíny a RCASBP(B)GFP (obď C) podskupinyB) a analyzovarry pomocífluorescenění mikroskopie.Původnibuňky DT40 byly citlívék infekci vektory s obaly obou podskupin. Naopak DT40 nc.,- klon byl velice Íezistentní infekci vektorem nesoucímobal podskupiny C, ale stále citliý k k in|ekci vektorempodskupiny B. Tato data potvrzují,že ná'rni identifikovarrýgen rvc je jediným receptorem vstupviru podskupinyC. pro citlivost k infekci viry ASLV nemá pouze bimodální charakter (citlivost vs. Některémutace mohou změnit vazebnémístovirovéhoreceptoru,Že vede ke rezistence). fenotypu.Charakterizacetakových semirezistentnich citlivosti a semřezistentrrímu snížené alel vřových receptorumůŽe data týkající vazby virovépartikulena poskytnoutdůležitá se ruzných kuřecíchlinií máme možnost Díky dostupnosti molekulu receptoru. lrledatlinie se jejich receptoru zněněnou citlivostík infekci viry ASLV' Detailníana|ýza muŽepomoci lépe vazby viru na virový Íeceptor. porozumětmechanismu jsme zjistili' Že linie M je Testovaním rezistentní infekci viry ASLV podskupinyB, D a E. Analyzovali jsme sekvenct častečrrě k lokusu rvĎ a nďezli jsme substifuciC1255 v doméně bohaté cystein3 (cRD3). Abychom na Tvb na citlivost kviru ASLV' byly posoudili vliv mutace Cl25S vkuřecím Íeceptoru infikovrírry fibroblastylinie M a BL nízkoukoncentracivektoru RCASBPGFP' embryoná.lni Potébyl sledovrinpruběh infekce a kvantifikovrírro GFP pozitivních mnoŽství buněk pomocí prutokové cýometrie.Embryonální fibroblastylinie BL jsou citlivék infekci viry podskupiny A, B, C a D a byly použityjakopozitivníkontrola.Jak se předpokládalo, fibroblastylinie M i BL byly úěinněinfrkovanyviry podskupinyC . téměřpolovinou buněk infikovanýchjeden den po infekci a v podstatě všemi buňkami infikovanými třetí den po infekci' Velice jestliŽe by|y fibroblasty infikovany viry podskupinyB. oďišných {sledku bylo dosaŽeno, byly fibroblasý linie BL infikovany viry podskupinyB podobnourychlosti Podle oěekávrirri jako viry podskupiny C. Avšak fibroblasty liníe M byly infikovany viry podskupiny B s výlazně niXí účinností virus se v kultuře buněk šíň| velmi pomalu. V odděleném a experimentubyly fibroblasty linie M infikovrtry vektory s obalem podskupin C, D a E, přičemž úěirrnost infekce'Stejnějakov prvnímexperimentu druhýden by|avyhodnocena této bylo 50% fibroblastů linie M infikovanokontrolním vektorempodskupinyC, ďe pouzevelmi málo jich bylo inťrkovánovektorem podskupiny D a žádné nebyly infikovany vektorem podskupinyE' Zminénádatajasně ukazují'žepřinejmenším kultivovanýchbuňkáchvede v 1 mutaceCl25S receptoruTvb k sniženécitlivosti embryonriLlních viry ASLV podskupinyB, která vede k v.ýznamnému linie M k infekci fibroblastů viru. Tato mutacediíle zpomalenišíření J sniŽeni citlivosti kvirum podskupiny D a téměř kompletní vede kještě l".ýraznějšímu rezistencik virum podskupinyE. Předchozídata.bylanavícpotvrzenatestoviiním afinity.vazba proteinuTvb linie M k obalov'.imglykoproteinům všechtři podskupinbyla detekován4avšaks výrazrrě virů niŽší afinitounežkproteinuTvb divokého typu:ASLV(B) s lOx až25x niXí afinitou, ASLV(D) s25x až50x niXí afinitoua ASLV(E) vykazoval pouzeminimálníafinituna hranicidetekce. jsme se Kromě analýzy vsfupuviru do buňky a strukturya funkce virových receptorů takézabýali přípravouvektorů vhodnýchpro dlouhodobou expresitransgenu. Tyto vektory jsou velmi užitečné určité pro typy experimentů lryžadujicích dlouhodobou expresitransgenu, pfipraw transgennichaniÍata také pro genovou terapii. Připravili jsme vektory, které exprimujígen v-src a jeho kinazově neaktivnímutantuY416F.K295N a zároveň obsahují rezistenčrrímarker. Infekcí křeččích fibroblastů těmito vektory a následnou selekcí antibiotikemjsme připravili buněčné |ínie stabi|něexprimujici v.src nebo jeho zmíněnou mutantu.Týo linie jsme použilike studiu vliw expresegenu v-src na aktivitu endogenniho Exprese konstitutivněaktivníhogenu v.src vedla k aktivaci endogenního genu c-.ýrc. c.src a celkovou proteintyrosinovoufosforylaci v infikovanýchbuňkách.Expresekinrázově zv'ýšení neal(ivni mutanty vedla kh}?ofosforylaci Tyr4l6 endogenního c.src. Jak aktivace tak inaktivace c.src můžebý rrysvětlenapřímou interakcív-src a c-src, která muže buď podněcovattrarrsfosforylaciregulačního Tyr4ló vpřípadě aktivace nebo naopak aktivaci tvorboupřechodných zabraňovat neaktivníchkomplexů mutantyY4 I6F.K295N a c-src. Výšezrniněné pro vektoryjsou vhodné dlouhodobou expresiv buněčných |iniích,kde je dostatekčasupro selekci transdukovaných buněk a taképro rese|ekciv připadě ztráty exprese. Týo vektory však nejsou vhodné pro pfipravu transgenních zvířat pomoci kmenovýchbuněk (SSC) a jejich transplantace kohoutů transdukcespermatogoniá'lních do steri|izovanýchopakovaným ozďováním y záÍením.To je způsobenoproblematickou jejich selekce,protoŽe delšíku|tivacesnižujejejich kultivaci SSC ln vino a nemožností schopnost kolonizovat semenotvornýepitel a ustanovit tak exogenní spermatogenezi. ExplantovanéSSC mohou být kultivovany pouze několik hodín rn vilro'coŽ poskytuje dostatekčasupouze pro účinnou infekci. Pro tento účel bylo nezbytné připravit virus ve vysokékoncentracia s oba|emschopnýminfikovat kuřecí SSC. Připravili jsme retrovirovy vektor odvozenýod viru myšíleukémie (MLv)' kteý je vysoce aktivnív ptačích buňkách. stomatitidy(vsV.G) a muŽebýt Tento vektor byl obalenglykoproteinem viru vesikulrimí G produkovan vkoncentraci vyšší než |o5 FFU/ml' Díky oba|u fvořenémVSV.G a jeho odolnosti,jsme byli schopni tentovirus koncentlovat pomoci u|tracentrifugace na úroveň až dosahujícílOt FFU/ml' Tato koncentrace viru je dostatečná pro účinnoutransdukci xplailovaných ssc. lnfikovali jsme kulturu rozvolněnýcb testikt{árnícb buněk koncentrovaným velÚorcm nesoucim Íeportéro\.ýgen pro GFP. Účinnost iďekce a Životaschopnostbuněk byla malyzována pomocí průtokové cytometrie. [úa|ýza metylace cpc dindrlootidů neodbdila á&rou výzaaonou mtylaci vekÍoruv infikovaných buŤkáďt naznačujío| epigenetieké'rri|čováninebrajevýznamou roli v tétofizi vývoje pohlavních že buněk. Po Ealsp|ntaci do sterilních kohoutůtyto buňky obnovily sprnatogeuzi běhm jako neinfikwmé hňky. U recipientníohkohoutů devíti ýdnů spřibližně stejnou ri'činnosti sodnovenou spermatogenezí genu' byla ve spermiích detekovfoa tiansórkce reportérového Nďe data ukazují, že stejně jako umyší nebo krys představuje transplantace reÚovh-e,m infikovoýcb wermategonií účinný systém pro vnášení genůdo samčíoh poHavnÍchbuněk a nfuledaoo přÍprwu Emsgennich ktťď. Výše aniněná dďa demonstrujivelikou univerzrálnost retoviroých vektorůpro účely přenosu geirů' avšak stále existuje mnoho obla$i pro \dzkum a zdokonalování stabilita expresevektoru zejména kmenových hrňlaicb je stá&e v z.áleátosti intenzirmibovýzkrmu.
Abstract v angličtině:
CONCLUSIONS Retroviral vectors are transcriptionally unstable in mammalian cells. The ASLV- derived vectors are the most affected by silencing. We modified the vector by insertion of the CpG island inner element (IE) into the vector LTR in three different positions in either sense or antisense orientation. Each vector variant exhibited a certain extent of stabilization. The vector with insertion of a tandem of two IEs between the enhancer and the promoter was the most stable and exhibited almost no silencing after four months of cultivation in rodent and human cells. The IE comprises two high-affinity Sp1 binding sites. The presence of Sp1 binding sites is important for the protective effect of IE, but at least a part of the entire anti-silencing capacity is maintained in IE with mutated Sp1 sites. We identified the Tvc receptor of ASLV. The tvc gene encodes a 488-amino-acid protein most closely related to mammalian butyrophilins, members of the immunoglobulin protein family. To confirm the identification of the Tvc receptor, we disrupted both tvc alleles in normally susceptible DT40 cells. The DT40 tvc-/- clone was resistant to the ASLV(C) infection. We identified the mutation that results in decreased susceptibility to infection by ASLV subgroups B and D and resistance to ASLV subgroup E of line M chickens. The tvb gene in line M, tvbr2, encodes a mutant TvbS1 receptor protein with substitution of a serine for a cysteine at position 125 (C125S). The C125S substitution significantly reduces the binding affinity of the TvbS1 receptor for the subgroup B, D, and E ASLV envelope glycoproteins. These are the first results that demonstrate a possible role of the cysteine- rich domain 3 in the function of the Tvb receptors. The MLV-based retroviral vectors expressing the v-src and kinase-dead double Y416F-K295N mutant were constructed. They were used for the preparation of stable cell lines expressing one of the variants of the src gene in order to assess the effect of these mutants on the c-src activity. We found that expression of the active v-src induced activation of endogenous c-src and increased general protein-tyrosine phosphorylation in the infected cells. Expression of the kinase-dead mutant induced hypophosphorylation of Tyr416 of the endogenous c-src. We prepared a MLV-based VSV-G pseudotyped vector capable of efficiently transducing spermatogonial stem cells (SSC). The explanted SSCs were infected with the 44 vector in vitro and subsequently transplanted into the testes of recipient cockerels sterilized by repeated γ-irradiation. The transduced reporter gene encoding the green fluorescent protein was detected in the sperms of recipient cockerels with restored spermatogenesis. 45
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Filip Šenigl, Ph.D. 642 kB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Filip Šenigl, Ph.D. 3.93 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Filip Šenigl, Ph.D. 2.63 MB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Filip Šenigl, Ph.D. 62 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Michal Šmahel, Ph.D. 1.07 MB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. 799 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 437 kB