velikost textu

Structure, activity and metabolism of human glutamate carboxypeptidase II

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Structure, activity and metabolism of human glutamate carboxypeptidase II
Název v češtině:
Struktura, aktivita a metabolismus lidské glutamátkarboxypeptidasy II
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Petra Mlčochová, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc.
Oponenti:
doc. MUDr. Jaroslav Blahoš, Ph.D.
prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc.
Id práce:
112610
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
6. 3. 2008
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ZAVER Nedávno publikované krystalové stÍuktuly GCPII poskytly náhled do organizace vazebné kapsy pro substrát a odhali|y něko|ik aminokyse|in, které se podílejí na vazbě substrátu/inhibitoru vsl' místě enzymu. Abychom doplnili a rozšíři|i strukturní studie, vytvořili jsme QM/T\4M model GCPII v komplexu se substrátem, N.acetyl-aspartyl. glutamátem (NAAG). To nám umožnilo předpovědět dalšíaminokyseliny důleŽitépro vazbu substrátu. Využili jsme místně speciťrcké mutageneze. abychom odhalili vliv těchto jednotlivých aminokyselin na vazbu substÍátu/inhibitoru a na enzymovou aktivitu GCPII. Poěítačovýmodel komp|exu GCPIVNAAG společně s výsledky z místně specifické mutageneze, ukazuje že aminokyse|iny v S1' místě (váaající glutarát) jsou nezbytné pro vysokou ďinitu substrátu nebo inhibitoru, zatímco, zbytky v s1 místě jsou více dťúežité při přeměně substrátu a mohly by hrát nějakou roli v kata|ytickém mechanismu enzymu. Přestože QMA4M model nám umožni| předpovědět strukturu a interakce mezi substrátem a enzymem v Sl místě, komp|exní popis reakčníhomechanismu GCPII je zatím mimo rámec našich možností. V blízkébudoucnosti bychom se rádi dozvěděli více informací o katalytickém mechanismu GCPII. Chceme se zaměřit na Glu424' který je situovián v bezprostřední blízkosti zinkťr v aktivním místě a s největší pravděpodobností se přímo účastní katalýzy. Mutace této aminokyseliny by nán mohla ukáaat její roli v enzyrnovém mechanismu, navíc mtižeme získat kIystalovou strukturu GCPII s nerozštěpeným substrátem N-acetyl-aspaItyl- glutamátem. Lidskou GCPII tvoří 750 aminokyselin a předpokládalo se, že její struktura se skládá ze šesti individurílních domén. Anatyzovali jsme příspěvek těchto předpovězených domén na stÍukturu a funkci rekombinantní |idské GCPII. Připravili jsme 13 mutantů GCPII, zkácených nebo prodloužených zC. nebo N. konce. S|edovali jsme jejich produkci v hmyzích buňkách a změřili jejich hydrolytickou aktivitu. Zjistili jsme' že zmény naC- i N-konci naruší hydrolytickou aktivitu a také negativně ovlivní správné sba]ení GCPII. Tuto studii jsme započali v době kdy ještě nebyly k dispozici krysta|ové stÍuktury GCPII. Nyní je již známo, že extrace|uliární doména GCPII se skládá ze tří částí'které tvoří velmi kompaktní strukturu (fo|d) a všechny tři tyto části tvoří aktivní místo enzymu. Proto je změna na obou koncích tak letání pro enzymovou aktivitu a správné sbalení proteinu. 2l ZískaLt jsme krystalové struktury lidské GCPII v komplexu s 2. (fosfonomethyl)pentandiovou kyselinou, kviskvalovou kyselinou a L.serin o-sulfiítem, což jsou mimetikďderiváty glutamátu. Přestože se tyto inhibitory mezi sebou struktumě liší, všechny velice podobně do S1' pďmísta GCPII a jsou zde stabilizovány kombinací se viíží polárních a van deÍ waa]soých interakcí. Z.dá se Že S l ' místo se při vazbě různých substrátu přeskupuje, aby interakce mezi substrátem a inhibitorem byly účinnější. Prezentované struktury, společně s dostupnými biochemickými daty' ukazují flexibilitu Sl' podmísta GCPII a podřhují strukturní rysy nutné pro účinný inhíbitor GCPII. Nďe data lze použít pro ývoj nových inhibitorů GCPII s lepšímifarmakokinetickými vlastnostmi a tím pádem lepšíúěinností proti GCPII. Pokusy s GCPII knokautovanými myšmi ukázaly' že v mozku se vyskytuje další enzym s NAAG-hydrolytickou aktivitou. Předpokládalí jsme, že se jedná o GCPIII' blízký homolog GCPtr, ten by mohl zastoupit aktivitu GCPII v těchto knokautech. Pfipravi1i jsme rekombinantní GCPII a ukázali, že její aktivita je ávislá na N. glykosylaci, je citlivá k několika známým inhibitorům GCPII' které jí efektivně inhibují. V porovnání s GCPII má poněkud nižší schopnost štěpit NAAG, jinou pH závislost a tÍochu jinou substrátovou speciťltu. Věříme, Že aktivita GCPtrI je natolik význačná, Že dokáže nahradit GCPII v knokautovaných myších.Naše výsledky mohou pomoci při vývoji účinnýcha selektivních inhibitorů obou enzymťt. Proě má ovšem mozek dva podobné proteiny se stejnou enzymovou aktivitou? odpověď je, že vlastně nevÍme. Možné vysvětlení je, Že GCPII a GcPn mají různou biologickou roli. Jedním z nďich cílůje najít interakěního paftneÍa GCPIII a vyjasnit její biologickou roli v mozku. Pouze omezené a kontroverzní data jsou publikované o lokalizaci a expresi GCPII v lidském mozku. Proto jsme se rozhďli systematicky analyzovat expresi GCPII v lidském mozku pomocí imunodetekce. Použili jsme novou protilátku GCP.04' která rozpoznává extracelulární část GcP[ a je citlivější ke GCPII než k homolognímu proteinu GCPII. Ukrízali jsme také, že je citlivější než komerčně používaná protilátka 7E1l. 22 Nalezli jsme expresi GCPII ve všech studovaných čiástech mozku, převážně v astÍocýech bíléhmoty. Nďe publikovaná data jsou jen odrazovým můstkem pro dalších studie zabývajícíse ro|í GCPtr v lidském mozku. Je obecně znárno' Že GCPII je exprimována v prostatě a ve vyššíchkoncentracích během rakoviny prostaty. Analogicky jsme ukázali, že GCPII je produkována astrocyty a rádi bychom prozkoumali možnostjejí exprese v nádorech mozku, hlavně v astÍocytomech. V benigní prostatě je mRNA PSM' produkována ve vyšší koncentraci než mRNA GCPII. Zajímavé je' že při rakovině pÍostaty je tomu naopak' Velmi omezené informace jsou k dispozici o proteinu PSM', zkrácené formy GCPII. My jsme se zaměřili na studium pťtvodu ploteinu PSM' a jeho v buňce. ''putování.. Naše pokusy ukáaa|y, že PSM' je proteolyticky aktivní N.glykosylovaný protein. Kupodivu to není produkt alternativního sestřihu mRNA GCPII, což je obecně uznávaná skutečnost. Předpokládali jsme, že se můžejednat o prďukt posttranslačního štěpení GCPII během internalizace a endocytózy do buňky' a|e ani tuto hypotézu jsme nepotvrdili. Můžeme jen spekulovat, že PSM' vzniká během cesty Golgiho apaÍátem a je přemístěna neznámým mechanismem do cytosolu buňky. Přestože pravý pťrvod PSM' je stále neznrámý, naše výsledky mohou zlepšit informace o metabolismu GCPII a jejího chování v buňce, stejně jako naše obecné znalosti o putování N.glykosylovaných cytosolárních proteinů v buňce. z-)
Abstract v angličtině:
CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES Recentry reported crystal sructures of GCpII provide stucturar insight into the organization of the substrate binding cavity and highlight residues implicated in substrate / inhibitor binding in the sIsite of the enzyme. To comprement and extend the s[ucturar studies, we constructed a QMzMM model of GCPII in complex with its substrate, N-aceýt. aspartyl-glutamate, which enabled us to pÍedict additional anrino acid residues interacting with the bound subsrate. and used site-directed mutagenesis to assess the contribution of individual residues for substrate ,/ inhibitor binding and enzymatic activity of GCpII. we prepared and characterized 12 GcpJ' mutants targeting the amino acids in the vicinity of substrate./inhibitor binding pockets. The experimental results suggest that residues (especiaily Arg210) in the sť site are critical for substrate./inhibitor binding, whereas the residues forming the sl pocket niight be more important for the .fine-tuning, of GCptr substrate specificity and appear to be relevant for substrate turnover and may play a role in the enzyme's mechanism of action. Even though the QIVýMM calculations of the NAAG binding mode in the GCPII active site enabled us to predict the structure and enzyme-substrate interactions in the sl binding site, the complete description of reaction mechanism of GCpII is beyond the scope of our study. we would rike to rook more closely into the catalytic mechanism of grutamate carboxypeptidase II. An interesting approach is a study of a putative proton sbuttle cru424, located near zinc ions in the acdve site of GCpII. The mutation of this residue might show us its role in enzyme catďysis; moreover' we might obtain a cfysta] structure of GCPII with bound unsplit substrate N_acetyl-aspartyl-gtutamate. Human GCpII consists of 750 amino acids, and six individuar domains were predicted to constitute the protein structure. we reported the analysis of the contribution of these putative domains to the sÍucture and function of recombinant human GCPII. We cloned l3 mutants of human GCPII that are tÍuncated or extended at one or both the N. and C.termini of the GCPII sequence. The crones were used to generate stably transfected Drosophila schneider's cells, and the expression and carboxypeptidase activities of the individual protein products were determined. The resurts crearly show that the amino acids at the extreme c_ terminus of GCpII are crucial for the hydrorytic activity of the enzyme and, furthermore. that no more than 60 amino acids can be deleted from the N-terminus without compromising the carboxypeptidase activity of GCpII. 21 we created a molecurar model of GCpIII and provided interpretation of the distinct substrate specificity of both enzymes, and examine the amino acid residues responsible tbr the differences by site-directed mutagenesis. These resuits may help to design potent and selective inhibitors of both enzymes. Such inhibitors would be helpfut to evaluate and distinguish biologicď roles of the two individual enzymes. we believe that GC'III acdvity is significant enough to account for the NAAG- hydrolyzing activity observed in the tissues of GCpII knock-out mice and that GCPIII misht thus represent a valid pharmaceutical target. why wourd brain harbour two similar enzymes with the same enzymatic activity? The honest answer is: we do not know. The possible expranation might be that GcpII and GcpI[ possess different biological roles in the brain. one of our goals is to find GCpIII molecular partner and to clarify the function of GCpl[. only very rimited and controversial data on the expression and localization of GCpII in human brain are available. Therefore, we set out the fřst systematic analysis of the expression of GCPII in hunran brďn using immunochemical detection' We used a novel monoclonar antibody GCp-04, which recognizes an epitope on the extracelrular part of the enzyme and is more sensirive to GC.II than to the homorogous protein GCpIII. we also showed that this antibody is more sensitive in immunobrots than the widely used antibody 7Ell. Immunohistochemical analysis revealed GCPII expÍession in all parts of the human brain' GCPII seems to be expressed exclusively in astrocytes, especiaily in those rocarized in the white matter' our published results are only starting point in further studies on the role of GCPII in the human brain. It is generď|y known that GCPII is expressed in prostiate and overexpressed during the prosarc cancer' Analogically' we showed GCPII expression ln astrocytes and we would like to investigate further the GCpII expression in brain tumors, especialry in the astfocytomas. In the benign pÍostate PsM' mRNA is overexpressed ovef GCPII. Interestingly enough, in the case of prosrate cancer this expression pattem is reversed. Very few information is known about protein designated pSM,, a runcated form of GCpII. We investigated the origin of PSM' and its trďficking in the cells. our experiments reveared that psM' is a proteorytica'y active N-linked grycoprotein. surprisingly, it is not a product of artemativery spliced ccplt mRNA, which is generalry accepted fact. we hypothesize that it might be a product of proteolytic processing of the fulr We undertook this study before the ťrst crystal structule of GCPII was determined. X- ray srucfures provided evidence that the ectodomďn of GCPII is composed of three domains. All these domains form active site of the enzyrne and are indispensable for the GCpII enzymatic activity' which explďns why changes on both N- and C. terminus ale so detrimental to protein stability and activity. we report crystal structures of the human GCpII complexed with three glutamate mimetics/derivatives, 2-(phosphonometbyl)pentanedioic acid, quisqualic acid, and Lserine O-sulfate. Despite the structural differences between the distal parts ofthe inhibitors, all three compounds share similar binding modes in the sl'site (pharmacophore pocket) of GCpII, where they are stabilized by a combination of polar and van der waals interactions. The structural variety of the distal parts of the inhibitors leads to rearrangements of the 51' site that are necessary for efficient interactions between the enzyme and an intribitor. The set of structures presented here, in connection with the available biochemicď data, illustÍates a flexibility of the GCPII pharmacophore pocket and underlines the structurď features required for potent GCPII inhibition. Our data could be used for the development of the new GCPII inhibitors using the rational structure-based drug design approach and could draw attention to the mďiÍication in the inhibitor structure, which can improve the pharmacokinetic profile and potency towards GCPIL Experiments with GCPII knock-out mice showed that GCpII is not the only one NAAG-hydrolyzing enzyme in the brain. We presumed that glutamate carboxypeptidase III (GCPIID, a close homolog of GCPII, might complemenr for GcpII activity in these knock- out mice. While human GCPII is an important pharmacological target in the neurotransmission and degenerative diseases, no biochemical study of human GCpIII is available at present. we cloned, expressed and characterized a recombinant human GCpil. We show that CCPItr lacks dipeptidylpepridase lV-like activity, its activity is dependent on N-glycosylation, and is sensitive to several known inhibitors ofGCpII effectively inhibit it. In comparison to GCPII, GCPIII has lower N.acetyl-aspaÍtyl.glutamate. hydrolyzing activity, different pH and sďt concentration dependence, and distinct substrate specificity. 22 length GCPII upon internalization and endosoma] trďfickin.g' but our data su.egest it is aJso not the case. we can only speculate that this species mi-eht be produced by a proteolytic processitr.e event inside the Go|gi apparatus and then tÍanslocated by an unknown mechanism into the cytosol. Insiphts into GCPII processinlg and the ori.ein of its truncate<l Íbrm PSM' might lmprove our understanding ofthe behavior ofGCPII. a therapeutic target for prostate cancer. as we]l as our .qeIreral understandine oí N-glycosylation and the Íaffickinp of cytosolic proteills. 24
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Petra Mlčochová, Ph.D. 2.37 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Petra Mlčochová, Ph.D. 15.23 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Petra Mlčochová, Ph.D. 888 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Petra Mlčochová, Ph.D. 1.23 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Jaroslav Blahoš, Ph.D. 118 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc. 168 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 426 kB