velikost textu

EF-Tu PROTEIN DOMAINS Functions and Thermostability

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
EF-Tu PROTEIN DOMAINS Functions and Thermostability
Název v češtině:
Elongační faktor EF-Tu Funkce a termostabitita domén
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Hana Šanderová, Ph.D.
Školitel:
prof. MUDr. Jiří Jonák, DrSc.
Oponenti:
Ing. Iva Pichová, CSc.
doc. RNDr. Karel Mikulík, DrSc.
Id práce:
112432
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie (P1515)
Obor studia:
Molekulární a buněčná biologie (XMOL)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
4. 7. 2008
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Souhrn disertačnípráce Bakteriá|ní faktorTu (EF-Tu)je jiŽ po deseti|etí e|ongační podrobně studovánpro svou k|íčovou v proteosyntéze. to modelová mu|tifunkční ro|i Je GTP-bí|kovina. Tato je bí|kovina téŽv centruzájmu,protoŽepředstavuje vhodnýcí|pro nová antibiotika' Kromě tohojsou bí|koviny EF-Tu díkyvysoké pro homo|ogii struktuře funkcivhodné studium ve a vztahů evo|učních mezi organismy pro zkoumání a strukturníchv|astností,které podmiňují mechanismy různým adaptační k podmínkám. Životním Všechny známé EF-Tujsou bÍlkoviny s|oŽenyze tří domén,a proto jsou vhodnýmimode|ovými pro bí|kovinami zkoumání uspořádní architektury domén bí|kovinách. v Jednímz h|avních projektů oddě|enígenovéexprese v Ústavu výzkumných na genetikyAV ČR, kde jsem vypracova|a mo|eku|ární práci, by|ostudium svou disertační primární regu|ace struktury, transkripce regulace a funkcí bakteriá|níhoe|ongačníhofaktoru Tu z Gram pozitivní termofilní bakterie Bacillus stearothermophilus z Gram negativní a mezofi|níbakterie Escherichiacoli. V tétoprácijsme se zabývali vztahemstruktury funkcemezi bí|kovinami a EF-Tu a jejichdoménami. domén doposudvětšinou V|iv byl zkoumánpomocí zkrácených foremEF- jednu nebo dvě doménybílkoviny. jsme se rozhod|i Tu, kterépostráda|y My studovat jednot|ivých v|astnosti domén rámci intaktních v třídoménovéch EF-Tu (za použiti bí|kovin bí|kovin chimerních s|oŽených rŮzných z kombinací domén EF-Tu z rŮzných organismů)a je porovnat se samotnou doménou (G-doménou). 1 Zabýva|ajsem dvěmaprojekty: se 1. Zkoumání vIivu iednotlivých domén bílkovin EF.Tu z E. coli a B. stearothermophilus základnífunkce EF.Tu, a to na vazbu GDP a GTP' GTPázvou na aktivitu,a na termostabilitu. Ukáza|ijsme, (i)G-doména EF-Tuz B. stearothermophilus GDP a GTP s Že a váŽou afinitami nanomo|árnísubmikromo|ární v a ob|asti, jsou shodné afinitami které s EF-TI z E. coli. Naopak, G-doména E' coli ztrati|a z afinituke GDP a GTP, typickoupro rozdí|nou intaktníEF-Tu,a váza|aoba nuk|eotidy niŽšími, s mikromo|eku|árními afinitami. E. colije Y přítomnost všechtří domén nutná pro dosaŽení vysoké rozdí|né a afinityke GDP a GTP. Naopak,jiŽ samotná G-doména B' stearothermophilus ke GDP a GTP vysokéa z má rozdí|néafinity. (ii) lzolované kata|ytické G-domény obou organismů z vykazova|y svých optimá|ních ve tep|otách podobnou Nekata|ytické GTPázovouaktivitu. domény ze zkoumaných 2+3 bí|kovin EF-Tu nicméně GTPázouvouaktivitu ov|ivňova|y rozdÍ|ně, závislostina svém G-domén v původu. 2+3z EF-Tu z E. coli inhibovaly Domény G-domény E. coli, GTPázovouaktivitu z 2+3z EF-Tu z B' stearothermophilus zatímcodomény stimu|ova|y GTPázu G-domény B' z stearothermophilus. (iii)Termostabi|ita obou EF-Tu by|avýs|edkemvzájemných interakcí mezi G-doménoua nastavova|y 2+3.G-domény doménami zák|adníÚroveňtermostabi|ity EF-Tu.Domény obou 2+3 dá|e stabi|izova|y cr-he|iká|ní G-domén tím i jejichfunkce na úroveň ob|asti a tep|ot shodných růstovými s tep|otními obouorganismů. optimy 2. Charakterizace prvků termostability G.domény z B. stearothermophilus srovnávacíanalýzous G.doménouzB. subtilis jsem, Že 12 aminokyse|inových Ukáza|i zbytků N-konciG-domény dů|eŽitou na má z Našeexperimenty roliv termostabilitě bí|koviny B. stearothemophilus. této dá|eukáza|y, že termostabi|izující N-konceby mohIbýtzpůsoben efekt stabiIizací efektorové ob|asti důleŽité pro zák|adnífunkce proteinu. V|iv N-konce by| také významnýpro termostabiIitu tří- EF-Tu. doménového Naše výs|edky přispě|yk pochopení uspořádání doménv hojně se vyskytujících - bílkovinách elongačních faktorechEF-Tu. Pomocísystematické ana|ýzy jsme ukáza|iv|iv domén EF-Tu na jeho funkcea termostabi|itu. Výs|edky získané běhemméhoPhD studia byly prezentovány pěti č|áncích, v něko|ikapřednáškách posterechna mezinárodních a konferencích'
Abstract v angličtině:
% The bacterial elongation factor Tu (EF-Tu) has been extensively studied for decades as it plays a key role in protein biosynthesis. It is a model, multifunctional GTP-protein. This protein is also in the centre of interest as a possible target for new antibiotics. Moreover, the high homology in structure and function makes EF-Tu proteins suitable for the studies of evolutionary relationships between organisms and for elucidation of the structural features of adaptation to various living conditions. Furthermore, since all known EF-Tu proteins are composed of three distinct domains, they can also serve as suitable models for the understanding of domain organization in proteins. One of the main research projects of the Department of Gene Expression at the Institute of Molecular Genetics AS CR, where I did my PhD studies, was the study of the primary structure, transcription regulation and functions of bacterial elongation factors Tu from Gram positive thermophilic bacterium Bacillus stearothermophilus and from Gram negative mesophilic bacterium Escherichia coli. In this work, we focused on the structure-function relationships between EF-Tu proteins and their domains. The domain effect had been before our studies tested mainly by truncated EF-Tu forms lacking one or two domains. In contrast, we decided to study the properties of individual domains within full-length three-domain EF-Tu proteins (by domain chimerization approach) in comparison to isolated domain 1 (G-domain). I focused on two topics: 1. Evaluation of the effect of individual domains of EF-Tu proteins from E. coli and B. stearothermophilus on their basic functions, namely GDP/GTP binding, GTPase activity and on the thermostability. We showed that (i) B. stearothermophilus EF-Tu and B. stearothermophilus G- domain bound GDP and GTP with differential affinities in nanomolar and submicromolar ranges, respectively. These affinities were fully comparable with those of E. coli EF-Tu. In contrast, the E. coli G-domain did not display the differential affinity for GDP and GTP, typical for intact EF-Tus, and bound both nucleotides with much lower, micromolar affinities. Therefore, in E. coli, all three domains were required for the high and differential affinity for GDP and GTP, a physiological feature of bacterial EF-Tus. In contrast, the B. stearothermophilus G-domain itself already possessed the high and differential affinity for GDP and GTP. (ii) The isolated catalytic G-domain of both EF-Tus displayed similar GTPase activities at their optimal temperatures. However, noncatalytic domains 2+3 of the EF-Tus influenced the GTPase activity of G-domains differently, depending on the domain origin. E. 6 coli domains 2+3 suppressed the GTPase activity of the E. coli G-domain, whereas those of B. stearothermophilus EF-Tu stimulated the B. stearothermophilus G-domain GTPase. (iii) We demonstrated that the overall thermostability level of either EF-Tu was the result of cooperative interactions between the G-domain and domains 2+3. It appeared that the G-domains set up a basal level of the thermostability of both EF-Tus. Domains 2+3 contributed by further stabilization of α-helical regions of G-domains. This in turn, allowed the G-domains to function at temperatures corresponding to growth temperature optima of respective bacteria. 2. Characterization of thermostability elements of B. stearothermophilus G- domain by comparative analysis with the B. subtilis G-domain. We demostrated that the N-terminal 12 amino acid residues play a key role in the thermostability of the G-domain. Our experiments further suggested that the thermostabilizing effect of the N-terminus could be mediated by stabilizing the functionally important effector region. The effect of the N-terminus was also significant for the thermostability of the full-length EF-Tu. Our results contribute to the understanding of domain arrangement of ubiquitously occurring proteins elongation factors Tu. By a systematic analysis, we investigated the effect of the domains on EF-Tu functions and thermostability. The results obtained during my PhD studies were presented in five papers, in several oral presentations and in numerous posters at international conferences. 7
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Hana Šanderová, Ph.D. 2.7 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Hana Šanderová, Ph.D. 1.18 MB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Hana Šanderová, Ph.D. 2.65 MB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Iva Pichová, CSc. 133 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Karel Mikulík, DrSc. 93 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 643 kB