velikost textu

S čiapočkou alebo bez čiapočky? Iniciácia translácie eukaryotov so zameraním na oportúnneho patogéna C. albicans.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
S čiapočkou alebo bez čiapočky? Iniciácia translácie eukaryotov so zameraním na oportúnneho patogéna C. albicans.
Název v češtině:
S čepičkou nebo bez čepičky? Iniciace translace eukaryot se zaměřením na opurtunního patogena C. albicans
Název v angličtině:
To cap or not to cap? Eukaryotic translation initiation with a special interest in human opportunistic pathogen C. albicans
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Zuzana Feketová, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D.
Oponenti:
doc. RNDr. František Půta, CSc.
Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.
Id práce:
110585
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
20. 9. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Slovenština
Klíčová slova:
čiapočka, eIF4E, C. albicans, CUG, IRES, databáza, HCV
Klíčová slova v angličtině:
cap, eIF4E, C. albicans, CUG, IRES, database, HCV
Abstrakt:
Abstrakt Candida albicans je bezpochyby veľmi dôležitý oportúnny patogén, ohrozujúci hlavne imunokompromitovaných pacientov. Pokiaľ viem, ide o jediný organizmus, ktorý je schopný prežívať s nemetylovanými čiapočkami nachádzajúcimi sa na 5´konci mRNA. Funkčnou analýzou som potvrdila, že orf19.7626 kóduje translačný iniciačný faktor 4E C. albicans (Ca4E). Predpoklad, že Ca4E proteín by mohol rozpoznávať nemetylované čiapočky, sa nám v modelovom organizme S. cerevisiae nepodarilo potvrdiť. Rod Candida má však aj ďalšiu zvláštnosť- dvojaké dekódovanie CUG kodónu. Vo veľkej väčšine prípadov je dekódovaný ako serín, ale môže ísť aj o leucín, takže vzniká tzv. "štatistický proteóm". Jeden takýto kodón je aj súčasťou mRNA Ca4E proteínu. U C. albicans by sa teda mohli vyskytovať súčasne dve varianty Ca4E - Ca4ELeu a Ca4ESer. Obe formy dokážu nahradiť eIF4E S. cerevisiae, ale spôsobujú termosenzitívny fenotyp, ktorý je výraznejší v prípade Ca4ELeu proteínu. Zmiernenie termosenzitívneho fenotypu sa podarilo docieliť koprodukciou Ca4E spolu s C. albicans eIF4G proteínom (Ca4G). Úlohou eIF4G je prepojiť mRNA s 43S podjednotkou ribozómu pomocou interakcie s eIF4E, ktorá zároveň zvyšuje afinitu eIF4E k čiapočke. Preto sa domnievam, že interakcia Ca4E s eIF4G proteínom S. cerevisiae nie je dostačujúca. Ca4G taktiež obsahuje jeden CUG kodón, ktorý však nemá v našom modelovom organizme vplyv na fenotyp. Ca4ELeu je menej stabilný aj pri purifikácii z baktérií, preto som pri kryštalografických pokusoch pracovala hlavne s Ca4ESer. Mikrokryštály, ktoré bude potrebné ešte optimalizovať, sa mi podarilo pripraviť z komplexu Ca4ESer s analógom čiapočky a komplexu "trunc.4E•m7GpppG•eIF4GHis peptid". Odstránenie neštruktúrovaného N-konca z eIF4E proteínu (trunc.4E) by malo zlepšiť rast kryštálov. Proteín kódovaný v C. albicans génom orf19.3914 vzdialene pripomína Ca4E, ale v S. cerevisiae sa ako funkčný eIF4E proteín nechová. Sám o sebe pravdepodobne nie je schopný zabezpečiť iniciáciu translácie mRNA molekúl s nemetylovanými čiapočkami, nakoľko nekomplementuje deléciu génu RNA metyltransferázy u S. cerevisiae. V priebehu doktorského štúdia som sa venovala aj projektu zameraného na výskum IRES elementov, v rámci ktorého som sa stala spoluautorkou dvoch priložených publikácií. Kľúčové slová: čiapočka, eIF4E, C. albicans, CUG, IRES, databáza, HCV
Abstract v angličtině:
Abstract Candida albicans belongs to serious human opportunistic pathogens, causing severe health complications to immunocompromised patients. To my best knowledge, it is the only organism that survives with unmethylated cap structures found on the 5´ends of mRNA molecules. Using functional assay, I demonstrated that orf19.7626 codes for C. albicans translation initiation factor 4E (Ca4E). We couldn´t prove our hypothesis, that Ca4E could be responsible for the unmethylated cap recognition in our model organism S. cerevisiae. Candida sp. possesses also another rather unusual feature – ambiguous CUG codon. In most of the cases, CUG is decoded as a serine, but sometimes also as a leucine. This gives rise to a so called "statistical proteome". One CUG codon is also part of the mRNA coding for Ca4E protein, therefore two versions of Ca4E—Ca4ELeu and Ca4ESer—might occur in C. albicans simultaneously. Both of them are able to rescue deletion of S. cerevisiae eIF4E gene, but they confer temperature sensitivity to the heterologous host. This phenotype is more pronounced with the Ca4ELeu version. We observed milder temperature sensitive phenotype after co-expression of Ca4E together with C. albicans eIF4G (Ca4G). Conformational coupling between eIF4E and eIF4G leads to enhanced affinity of eIF4E to the cap structure and facilitates connection of mRNA with 43S ribosome subunit. It is therefore possible, that heterologous interaction of Ca4E with S. cerevisiae eIF4G is not able to fully supply these functions. Ca4G also contains one CUG codon, which doesn´t have impact on any phenotype in our model system. Ca4ELeu is also less stable when purified from bacterial cultures; therefore I used predominantly the Ca4ESer protein for the crystallography trials. I was able to prepare microcrystals from 2 complexes: Ca4ESer•m7GTP and "trunc.4E•m7GpppG•eIF4GHis peptid". However, both of them need to be further optimized. I employed shorter Ca4E version as truncation of the unstructured N-terminus from Ca4ESer (trunc.4E) should enhance crystal growth. Protein encoded by C. albicans orf19.3914 loosely resembles the Ca4E factor, but doesn’t behave as such in S. cerevisiae. It is also not able to rescue growth of S. cerevisiae strains defective in mRNA capping. I conclude that this protein alone cannot bind unmethylated cap structures. During my PhD studies, I also took part in research devoted to IRES elements and became a co- author of two enclosed publications. Key words: cap, eIF4E, C. albicans, CUG, IRES, database, HCV
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Zuzana Feketová, Ph.D. 10.61 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Zuzana Feketová, Ph.D. 77 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Zuzana Feketová, Ph.D. 66 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. František Půta, CSc. 66 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D. 156 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 905 kB