velikost textu

Studium funkce Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz Pseudomonas aeruginosa

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium funkce Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz Pseudomonas aeruginosa
Název v angličtině:
Functional studies of Ser/Thr protein kinases and phosphatases of Pseudomonas aeruginosa
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Jana Goldová, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Pavel Branny, CSc.
Oponenti:
RNDr. Jan Nešvera, CSc.
doc. RNDr. Alena Španová, CSc.
Id práce:
110259
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Mikrobiologie (P1510)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
21. 9. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
Pseudomonas aeruginosa, Ser/Thr proteinkinázy a fosfatázy, virulence, odolnost ke stresům
Klíčová slova v angličtině:
Pseudomonas aeruginosa, Ser/Thr protein kinases and phosphatases , virulence, stress resistance
Abstrakt:
Abstrakt Reverzibilní fosforylace proteinů je považována za univerzální mechanizmus v intracelulární komunikaci všech živých organizmů. Tento proces, katalyzovaný proteinkinázami a fosfatázami, umožňuje přeložit extracelulární signály do odpovídající buněčné odpovědi a umožňuje tak adaptaci na změny podmínek v prostředí. V posledních letech byla objevena celá řada Ser/Thr proteinkináz a fosfatáz eukaryotního typu u bakterií, jejich přesná funkce a substráty však nejsou zatím příliš prostudovány. Podmíněný lidský patogen Pseudomonas aeruginosa obsahuje ve svém chromozomu minimálně 5 genů kódujících předpokládané Ser/Thr proteinkinázy a fosfatázy eukaryotního typu. V první části této práce jsme se pokusili stanovit fyziologickou roli Ser/Thr proteinkinázy PpkA a fosfatázy PppA, které jsou součástí sekrečního systému typu VI H1-T6SS. V kmeni P. aeruginosa PAO1 jsme připravili dvojitého delečního mutanta ∆pppA- ppkA. Fenotypová analýza prokázala, že v porovnání s divokým kmenem vykazuje mutantní kmen pomalejší růst v minimálním médiu a sníženou produkci pigmentu pyocyaninu. Mutant dále prokazoval významně sníženou odolnost k oxidativnímu stresu a naopak zvýšenou odolnost k hyperosmotickému stresu. V souladu s pozorovanou sníženou odolností k oxidativnímu stresu mutantní kmen hůře přežíval v baktericidním prostředí uvnitř myších makrofágů a také nebyl schopen navodit infekci v rostlinném modelu. Porovnání transkriptomů mutantního a divokého kmene odhalilo vliv delece genů pppA- ppkA na expresi genů odpovědi na oxidativní stres, genů regulovaných stacionárním σ- faktorem RpoS a genů regulovaných quorum sensing (QS) systémy. Transkriptomy mutanta a divokého kmene byly porovnány rovněž za podmínek oxidativního stresu. Tato analýza ukázala na změněný rozsah odpovědi k oxidativnímu stresu, která se projevovala deregulací exprese ve všech podskupinách genů odpovědi k oxidativnímu stresu. Kromě těchto genů jsme pozorovali změnu exprese genů pod kontrolou QS systémů las/rhl a genů Pho regulonu. Z dosažených výsledků vyvozujeme, že proteinkináza PpkA s fosfatázou PppA jsou globálními regulátory, které se kromě své funkce v sekrečním systému typu VI podílí také na regulaci stresové odpovědi a tak ovlivňují virulenci P. aeruginosa. V druhé části této práce jsme se věnovali studiu interakcí Ser/Thr proteinkinázy Stk1 s fosfatázou Stp1 a jejich předpokládaným substrátovým proteinem Fha2. Tyto proteiny jsou součástí sekrečního systému typu VI H2-T6SS. Připravili jsme rekombinantní protein Fha2 a potvrdili jeho fosforylaci proteinkinázou Stk1 in vitro. Imunodetekcí s protilátkou proti fosforylovanému threoninu jsme dále zjistili, že protein Fha2 je kinázou Stk1 fosforylován na threoninu. Určit přesné místo fosforylace proteinu Fha2 pomocí cílené mutageneze pravděpodobných cílových aminokyselin se nám nepodařilo. Dále jsme studovali efekt fosforylace fosfatázy Stp1 na její aktivitu. Místně specifická mutageneze identifikovaného fosforylovaného threoninu 90 neprokázala vliv na fosfatázovou aktivitu Stp1 vůči svému substrátu, kináze Stk1. V in vitro kinázové reakci jsme nepozorovali fosforylaci fosfatázy Stp1 kinázou Stk1 na threoninu.
Abstract v angličtině:
Abstract Reversible protein phosphorylation is considered the universal language for intracellular communication in all living organisms. This process, catalysed by protein kinases and phosphatases, enables the translation of extracellular signals into cellular responses and also allows for adaptation to a constantly changing environment. In recent years, a number of bacterial eukaryotic-type Ser/Thr protein kinases and phosphatases have been identified. However, their precise functions and substrates are not yet well defined. The genome of opportunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa contains at least five genes encoding putative eukaryotic-type Ser/Thr protein kinases and phosphatases. In the first part of this study, we have attempted to establish the role of Ser/Thr protein kinase PpkA and phosphatase PppA, which belong to type VI secretion system H1-T6SS. Double mutant strain ∆pppA-ppkA was prepared in P. aeruginosa PAO1 background. Phenotypic studies revealed that the mutant grew slower than the wild-type strain in minimal media and exhibited reduced secretion of pigment pyocyanin. In addition, the mutant had altered sensitivity to oxidative and hyperosmotic stress conditions. Consequently, mutant cells had an impaired ability to survive in murine macrophages and an attenuated virulence in the plant model of infection. Whole-genome transcriptome analysis revealed that pppA-ppkA deletion affects the expression of oxidative stress- responsive genes, stationary phase σ-factor RpoS-regulated genes as well as quorum- sensing regulons. The transcriptome of the pppA-ppkA mutant was also analysed under conditions of oxidative stress and showed an impaired response to the stress, manifested by a weaker induction of stress adaptation genes as well as the genes of the SOS regulon. In addition, expression of either quorum-sensing-dependent genes or RpoS-regulated genes and genes of Pho regulon was also affected. Our results suggest that in addition to its crucial role in controlling the activity of P. aeruginosa H1-T6SS at the post-translational level, the PppA-PpkA pair also affects the transcription of stress-responsive genes. Based on these data, it is likely that the reduced virulence of the mutant strain results from an impaired ability to survive in the host due to the limited response to stress conditions. In the second part of this study, we focused on interactions of Ser/Thr protein kinase Stk1 with phosphatase Stp1 and their putative substrate protein Fha2. These proteins belong to the type VI secretion system H2-T6SS. We prepared recombinant protein Fha2 and proved its phosphorylation by the Stk1 kinase in vitro. Immunodetection with anti-phospho-treonine antibody revealed further that Fha2 is phosphorylated by the Stk1 on threonine residue(s). However, our attempts to determine precise site of phosphorylation of Fha2 by the site directed mutagenesis of predicted target amino acid residues failed. We have also studied the effect of Stp1 phosphorylation on its activity. Site directed mutagenesis of previously identified phospho- threonine 90 did not affect phosphatase activity of Stp1. Furthermore, no phosphorylation of Stp1 by Stk1 in in vitro conditions was observed.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Jana Goldová, Ph.D. 265.79 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Jana Goldová, Ph.D. 53 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Jana Goldová, Ph.D. 39 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jan Nešvera, CSc. 93 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Alena Španová, CSc. 89 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 640 kB