text size

Komparativní analýza shluků genů pro biosyntézu linkomycinu a celesticetinu

Notice: I hereby declare that I am aware that the information acquired from theses published by Charles University may not be used for commercial purposes or may not be published for educational, scientific or other creative activities as activities of person other than the author.
Title:
Komparativní analýza shluků genů pro biosyntézu linkomycinu a celesticetinu
Titile (in english):
Comparative analysis of celesticetin and lincomycin biosynthetic gene clusters
Type:
Rigorosum thesis
Author:
RNDr. Markéta Koběrská, Ph.D.
Thesis Id:
108320
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Genetics and Microbiology (31-140)
Study programm:
Biology (N1501)
Study branch:
Microbiology (NMIKRO)
Degree granted:
RNDr.
Defence date:
29/06/2011
Defence result:
Pass
Language:
Czech
Abstract (in czech):
Komparativní analýza shluků genů pro biosyntézu linkomycinu a celesticetinu Markéta Koběrská Úvodní část dizertační práce se zabývá izolací, sekvenční analýzou a heterologní expresí shluku pro biosyntézu linkomycinu izolovaného z typového kmene Streptomyces lincolnensis ATCC 25466. Komparativní analýza se shlukem genů z nadprodukčního kmene Streptomyces lincolnensis 78-11 ukázala dvě rozsáhlé změny sekvence a několik stovek bodových mutací. Analýza sekvence okolí shluku upřesnila umístění shluku v genomu producenta. Kosmid nesoucí celý shluk pro biosyntézu linkomycinu byl následně vložen do genomu dvou modelových streptomycet: Streptomyces coelicolor CH 999 a Streptomyces coelicolor M 145. Takto modifikované kmeny heterologně produkovaly linkomycin, i když produkce klesla na 1-3% produkce naměřené u S. lincolnensis ATCC 25466. Na základě přesné sekvence linkomycinového genového shluku z typového kmene byl identifikován a analyzován shluk genů pro biosyntézu strukturně příbuzného antibiotika celesticetinu. Analýza ukázala 24 otevřených čtecích rámců, 18 z nich je homologních s geny z linkomycinového shluku genů, 4 geny kódují tvorbu a připojení salicylátové podjednotky celesticetinu, dále shluk obsahuje jeden gen pro rezistenci a jeden gen kódující specifickou ornamentaci antibiotika. Geny nesoucí informaci pro biosyntézu jednotlivých částí antibiotik mají stavenicové uspořádání. Dvanáct genů, které pravděpodobně kódují biosyntézu aminocukerné podjednotky linkosamidových antibiotik, je konzervováno v obou shlucích a rozděleno do dvou kompaktně se pohybujících modulů. Mezi tyto dva moduly je v genovém shluku celesticetinu vložena čtveřice genů, ccbD/lmbD, ccbE/lmbE a ccbF/lmbF, kódujících pravděpodobné podjednotky klíčového kondenzačního enzymu N-demethyllinkomycinsynthetasy (NDLS). Výsledky inaktivačních pokusů a proteinových interakcí potvrdily, že proteiny kódované těmito geny tvoří jádro NDLS. K unikátnímu pohybu na podgenové úrovni došlo během vývoje linkosamidů v případě sekvence kódující peptidylový přenašeč, další nezbytné komponentě NDLS. V celesticetinovém genovém shluku tato sekvence tvoří 3´ konec genu ccbZ, zatímco ve shluku pro biosyntézu linkomycinu je připojena na 5´ konci genu lmbN, který sousedí s lmbZ, protějškem genu ccbZ. Během evoluce tedy došlo k „přeskoku“ sekvence kódující PCP z konce jednoho genu na začátek sousedního. Sekvenční analýza biochemicky příbuzných pyrrolobenzodiazepinových (PBD) antibiotik ukázala, že linkomycinový shluk pravděpodobně vznikl fúzí shluku genů linkosamidového antibiotika začleňujícího původně prolin se shlukem PBD antibiotika syntetizujícího a integrujícího do své struktury derivát 4-propyl-L-prolinu. Adaptace substrátové specifity enzymu NDLS spojujícího obě podjednotky antibiotika proběhla jen díky několika bodovým mutacím jeho podjednotek.
Abstract:
Comparative analysis of celesticetin and lincomycin biosynthetic gene clusters Markéta Koběrská The introductory part of the thesis presents isolation and sequencing of lincomycin gene cluster from type strain Streptomyces lincolnensis ATCC 25466. Two relatively extensive sequence changes and several hundred point mutations were identified if compared with the previously published sequence of the lincomycin industrial strain Streptomyces lincolnensis 78-11. Analysis of the cluster flanking regions revealed its localization within the genome of S. lincolnensis ATCC 25466. The cluster-bearing cosmid was integrated into the chromosome of lincomycin non-producing strains Streptomyces coelicolor CH 999 and Streptomyces coelicolor M 145. The modified strains heterologously produced lincomycin, but the level dropped to approximately 1-3% of the production in S. lincolnensis ATCC 25466. The exact sequence of lincomycin gene cluster from the type strain allowed isolation and sequence analysis of the gene cluster of structurally related celesticetin. The analysis revealed 24 putative genes, 18 of them homologous with the genes participating in lincomycin biosynthesis. Four celesticetin specific genes are encoding enzymes involved in the salicylate biosynthesis and attachment, one is coding for celesticetin ornamenting methyltransferase and one is a putative resistance gene. The genetic information for biosynthesis of salicylate and amino sugar building units of celesticetin is prefabricated, i.e. organized in compact gene blocks. Analysis of biochemically related antibiotic gene clusters shows that lincomycin biosynthetic cluster originated from a fusion of two ancestral biosynthetic gene clusters, one coding for proline-incorporating lincosamide, the other for pyrrolobenzodiazepine compound with incorporated 4-propyl-L-proline derivative. Both related lincosamide biosynthetic clusters share compactly transferred four-gene module ccbC/lmbC- ccbF/lmbF. Results of gene inactivation and screening of protein-protein interaction proved that their protein products form the core of the crucial multimeric N-demethyllincosamide synthetase (NDLS) complex. The sequence coding for the remaining part of NDLS, the peptidyl carrier protein (PCP), forms 5´-terminal part of the gene lmbN in the lincomycin cluster but 3´-terminal part of the ccbZ, the adjoining gene of the lmbN counterpart in the celesticetin cluster. Consequently, PCP-coding sequence jumped between two adjoining genes during the evolution. Both NDLSs involved in celesticetin and lincomycin biosynthesis consist of an identical set of mutually homologous subunits. The evolutionary adaptation of the enzyme substrate specificity to the newly emerging unusual amino acid 4-propyl-L- proline in lincomycin biosynthesis thus resulted only from point mutations of the NDLS subunits.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis RNDr. Markéta Koběrská, Ph.D. 3.5 MB
Download Abstract in czech RNDr. Markéta Koběrská, Ph.D. 14 kB
Download Abstract in english RNDr. Markéta Koběrská, Ph.D. 12 kB
Download Defence's report 552 kB