velikost textu

EF-Tu Protein Domains:Functions and Thermostability

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
EF-Tu Protein Domains:Functions and Thermostability
Název v češtině:
Elongační faktor EF-Tu: Funkce a termostabilita domén
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
RNDr. Hana Šanderová, Ph.D.
Id práce:
107397
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Genetika, molekulární biologie a virologie (NGEMOVI)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
11. 5. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra genetiky a mikrobiologie Elongační faktor EF-Tu Funkce a termostabilita domén Disertační práce Hana Šanderová Specializace: Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie Školitel: Prof. MUDr. Jiří Jonák, DrSc. Oddělění genové exprese, Ústav molekulární genetiky AV ČR Praha 2008 Souhrn disertační práce Bakteriální elongační faktor Tu (EF-Tu) je již po desetiletí podrobně studován pro svou klíčovou roli v proteosyntéze. Je to modelová multifunkční GTP-bílkovina. Tato bílkovina je též v centru zájmu, protože představuje vhodný cíl pro nová antibiotika. Kromě toho jsou bílkoviny EF-Tu díky vysoké homologii ve struktuře a funkci vhodné pro studium evolučních vztahů mezi organismy a pro zkoumání strukturních vlastností, které podmiňují adaptační mechanismy k různým životním podmínkám. Všechny známé bílkoviny EF-Tu jsou složeny ze tří domén, a proto jsou vhodnými modelovými bílkovinami pro zkoumání architektury uspořádní domén v bílkovinách. Jedním z hlavních výzkumných projektů na Oddělení genové exprese v Ústavu molekulární genetiky AV ČR, kde jsem vypracovala svou disertační práci, bylo studium primární struktury, regulace transkripce a regulace funkcí bakteriálního elongačního faktoru Tu z Gram pozitivní termofilní bakterie Bacillus stearothermophilus a z Gram negativní mezofilní bakterie Escherichia coli. V této práci jsme se zabývali vztahem struktury a funkce mezi bílkovinami EF-Tu a jejich doménami. Vliv domén byl doposud většinou zkoumán pomocí zkrácených forem EF- Tu, které postrádaly jednu nebo dvě domény bílkoviny. My jsme se rozhodli studovat vlastnosti jednotlivých domén v rámci intaktních třídoménovéch bílkovin EF-Tu (za použití chimerních bílkovin složených z různých kombinací domén EF-Tu z různých organismů) a porovnat je se samotnou doménou 1 (G-doménou). Zabývala jsem se dvěma projekty: 1. Zkoumání vlivu jednotlivých domén bílkovin EF-Tu z E. coli a B. stearothermophilus na základní funkce EF-Tu, a to na vazbu GDP a GTP, GTPázvou aktivitu, a na termostabilitu. Ukázali jsme, že (i) G-doména a EF-Tu z B. stearothermophilus vážou GDP a GTP s afinitami v nanomolární a submikromolární oblasti, které jsou shodné s afinitami EF-Tu z E. coli. Naopak, G-doména z E. coli ztratila rozdílnou afinitu ke GDP a GTP, typickou pro intaktní EF-Tu, a vázala oba nukleotidy s nižšími, mikromolekulárními afinitami. V E. coli je přítomnost všech tří domén nutná pro dosažení vysoké a rozdílné afinity ke GDP a GTP. Naopak, již samotná G-doména z B. stearothermophilus má ke GDP a GTP vysoké a rozdílné afinity. (ii) Izolované katalytické G-domény z obou organismů vykazovaly ve svých optimálních teplotách podobnou GTPázovou aktivitu. Nekatalytické domény 2+3 ze zkoumaných bílkovin EF-Tu nicméně ovlivňovaly GTPázouvou aktivitu G-domén rozdílně, v závislosti na svém původu. Domény 2+3 z EF-Tu z E. coli inhibovaly GTPázovou aktivitu G-domény z E. coli, zatímco domény 2+3 z EF-Tu z B. stearothermophilus stimulovaly GTPázu G-domény z B. stearothermophilus. (iii) Termostabilita obou EF-Tu byla výsledkem vzájemných interakcí mezi G-doménou a doménami 2+3. G-domény nastavovaly základní úroveň termostability obou EF-Tu. Domény 2+3 dále stabilizovaly α-helikální oblasti G-domén a tím i jejich funkce na úroveň teplot shodných s růstovými teplotními optimy obou organismů. 2. Charakterizace prvků termostability G-domény z B. stearothermophilus srovnávací analýzou s G-doménou z B. subtilis Ukázali jsem, že 12 aminokyselinových zbytků na N-konci G-domény má důležitou roli v termostabilitě této bílkoviny z B. stearothemophilus. Naše experimenty dále ukázaly, že termostabilizující efekt N-konce by mohl být způsoben stabilizací efektorové oblasti důležité pro základní funkce proteinu. Vliv N-konce byl také významný pro termostabilitu tří- doménového EF-Tu. Naše výsledky přispěly k pochopení uspořádání domén v hojně se vyskytujících bílkovinách - elongačních faktorech EF-Tu. Pomocí systematické analýzy jsme ukázali vliv domén EF-Tu na jeho funkce a termostabilitu. Výsledky získané během mého PhD studia byly prezentovány v pěti článcích, několika přednáškách a posterech na mezinárodních konferencích.
Abstract v angličtině:
Charles University in Prague Faculty of Science Department of Genetics and Microbiology EF-Tu PROTEIN DOMAINS Functions and Thermostability PhD thesis Hana Šanderová Specialization: Molecular and Cellular Biology, Genetics and Virology Supervisor: Prof. MUDr. Jiří Jonák, DrSc. Department of Gene Expression, Institute of Molecular Genetics AS CR Prague 2008 Summary of PhD Thesis The bacterial elongation factor Tu (EF-Tu) has been extensively studied for decades as it plays a key role in protein biosynthesis. It is a model, multifunctional GTP-protein. This protein is also in the centre of interest as a possible target for new antibiotics. Moreover, the high homology in structure and function makes EF-Tu proteins suitable for the studies of evolutionary relationships between organisms and for elucidation of the structural features of adaptation to various living conditions. Furthermore, since all known EF-Tu proteins are composed of three distinct domains, they can also serve as suitable models for the understanding of domain organization in proteins. One of the main research projects of the Department of Gene Expression at the Institute of Molecular Genetics AS CR, where I did my PhD studies, was the study of the primary structure, transcription regulation and functions of bacterial elongation factors Tu from Gram positive thermophilic bacterium Bacillus stearothermophilus and from Gram negative mesophilic bacterium Escherichia coli. In this work, we focused on the structure-function relationships between EF-Tu proteins and their domains. The domain effect had been before our studies tested mainly by truncated EF-Tu forms lacking one or two domains. In contrast, we decided to study the properties of individual domains within full-length three-domain EF-Tu proteins (by domain chimerization approach) in comparison to isolated domain 1 (G-domain). I focused on two topics: 1. Evaluation of the effect of individual domains of EF-Tu proteins from E. coli and B. stearothermophilus on their basic functions, namely GDP/GTP binding, GTPase activity and on the thermostability. We showed that (i) B. stearothermophilus EF-Tu and B. stearothermophilus G-domain bound GDP and GTP with differential affinities in nanomolar and submicromolar ranges, respectively. These affinities were fully comparable with those of E. coli EF-Tu. In contrast, the E. coli G-domain did not display the differential affinity for GDP and GTP, typical for intact EF-Tus, and bound both nucleotides with much lower, micromolar affinities. Therefore, in E. coli, all three domains were required for the high and differential affinity for GDP and GTP, a physiological feature of bacterial EF-Tus. In contrast, the B. stearothermophilus G-domain itself already possessed the high and differential affinity for GDP and GTP. (ii) The isolated catalytic G-domain of both EF-Tus displayed similar GTPase activities at their optimal temperatures. However, noncatalytic domains 2+3 of the EF-Tus influenced the GTPase activity of G-domains differently, depending on the domain origin. E. coli domains 2+3 suppressed the GTPase activity of the E. coli G-domain, whereas those of B. stearothermophilus EF-Tu stimulated the B. stearothermophilus G-domain GTPase. (iii) We demonstrated that the overall thermostability level of either EF-Tu was the result of cooperative interactions between the G-domain and domains 2+3. It appeared that the G-domains set up a basal level of the thermostability of both EF-Tus. Domains 2+3 contributed by further stabilization of α-helical regions of G-domains. This in turn, allowed the G-domains to function at temperatures corresponding to growth temperature optima of respective bacteria. 2. Characterization of thermostability elements of B. stearothermophilus G- domain by comparative analysis with the B. subtilis G-domain. We demostrated that the N-terminal 12 amino acid residues play a key role in the thermostability of the G-domain. Our experiments further suggested that the thermostabilizing effect of the N-terminus could be mediated by stabilizing the functionally important effector region. The effect of the N-terminus was also significant for the thermostability of the full-length EF-Tu. Our results contribute to the understanding of domain arrangement of ubiquitously occurring proteins elongation factors Tu. By a systematic analysis, we investigated the effect of the domains on EF-Tu functions and thermostability. The results obtained during my PhD studies were presented in five papers, in several oral presentations and in numerous posters at international conferences.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Hana Šanderová, Ph.D. 739 kB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Hana Šanderová, Ph.D. 2.14 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Hana Šanderová, Ph.D. 307 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Hana Šanderová, Ph.D. 294 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Stanislav Zadražil, DrSc. 80 kB