velikost textu

Vlastnosti a apoptóza jaterních hvězdicových buněk v cirhotických játrech potkanů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Vlastnosti a apoptóza jaterních hvězdicových buněk v cirhotických játrech potkanů
Název v angličtině:
General features of hepatic stellate cells undergoing apoptosis in cirrhotic rat liver
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lenka Bittnerová, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jiří Kanta, CSc.
Oponenti:
prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc.
doc. MUDr. Vladislav Krtek, CSc.
Id práce:
107298
Fakulta:
Lékařská fakulta v Hradci Králové (LFHK)
Pracoviště:
Ústav lékařské biochemie (15-180)
Program studia:
Lékařská chemie a biochemie (P5120)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
10. 9. 2013
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
SOUHRN Jaterní fibróza vzniká v důsledku chronických jaterních onemocnění a působením nejrozličnějších příčin či podnětů. Dochází k nadměrné tvorbě, hromadění a ukládání extracelulární matrix (ECM), především kolagenu typu I, která způsobuje přestavbu jater a může přejít až v jaterní cirhózu. Jde o dynamický proces novotvorby a odbourávání ECM, které je produkováno zejména jaterními hvězdicovými buňkami (HSC). HSC se nacházejí v Disseho prostoru, hrají důležitou roli v hospodaření s vitamínem A. Při poškození jater se z klidového (quiescent) stadia aktivují, proliferují, získávají myofibroblastový fenotyp a produkují velké množství ECM. Experimentální studie prokázaly vratnost fibrotického procesu, přičemž možnost, jak snížit počet nadbytečných aktivovaných HSC je odstranění pomocí programované buněčné smrti (apoptózy), nebo návrat zpět do klidového stavu. Cílem naší práce bylo popsat a navzájem porovnat buňky klidové, aktivované in vitro a in vivo. Zaměřili jsme se na vliv trojrozměrné kolagenní matrix na apoptózu jaterních hvězdicových buněk, neboť vliv kolagenu typu I na apoptózu nebyl doposud sledován. In vivo byla aktivace HSC vyvolána intragastrickým podání třech dávek tetrachlormethanu potkanům. In vitro jsme apoptózu indukovali třemi rozdílnými toxiny – gliotoxinem, cykloheximidem a cytochalasinem D. HSC jsme izolovali z normálních i akutně poškozených jater potkanů enzymatickou perfuzí a centrifugací v hustotním gradientu. Izolovali jsme HSC s odlišnými fenotypy – klidové, aktivované in vitro a in vivo, a ty byly kultivované na plastu a na kolagenním gelu po 7 dní. Sledovali jsme dynamiku jejich růstu, morfologii, expresi 94 genů pomocí oligo cDNA, imunocytochemicky hladkosvalový α-aktinu (α-SMA) a apoptotické proteiny Bax a Bcl-2. Apoptóza byla detekována kombinací dvou nezávislých metod – fluorescenčními barvivy a průtokovou cytometrií. Klidové HSC z nepoškozených jater se na plastu transdiferencovaly na buňky aktivované s myofibroblastovým genotypem i fenotypem. Během aktivace došlo k řadě změn v expresi různých skupin genů, které jsme sledovali pomocí oligo cDNA arrayí. Kolagenní gel ovlivnil morfologii všech buněk, které tak získaly vzhled podobný buňkám in vivo. Aktivované HSC se vyznačují pozitivitou α- SMA způsobující jejich kontraktilní vlastnosti. Ten se prodlužující kultivací na kolagenním gelu u části buněk vytratil, což potvrdilo teorii, že se část aktivovaných HSC navrací do klidového stádia. Část aktivovaných buněk podléhala spontánní apoptóze, jíž byl nadbytečný počet HSC regulován. Procento apoptotických buněk kultivovaných na kolagenním gelu bylo u všech typů buněk výrazně vyšší, stejně jako se zvyšoval apoptotický index proteinů Bcl-2 rodiny. Zavedli jsme metody navození apoptózy pomocí gliotoxinu, cyklohemidu a cytochalasinu D. Kolagenní gel zároveň potencoval a urychloval apoptózu vyvolávanou toxiny, přestože je mechanismus účinku navození apoptózy je u každého z nich jiný. Interakce jaterních hvězdicových buněk v poškozených játrech se složkami extracelulární matrix hraje důležitou roli v návratu fibrotického poškození k původnímu stavu. Lze tedy říci, že nezáleží na tom, jakým způsobem byla apoptóza způsobena, ale kolagenní matrix, která se v játrech akumuluje při rozvoji jaterní fibrózy, tento proces akceleruje a může velmi výrazně ovlivnit životní cyklus a chování jaterních hvězdicových buněk. Proto je navození či ovlivnění apoptózy HSC v dnešní době významným, strategicko-terapeutickým, antifibrotickým cílem.
Abstract v angličtině:
SUMMARY Liver fibrosis represents a significant worldwide health problem. It is a response of liver to repeated injury and it is characterized by breakdown of normal extracellular matrix (ECM) resembling basement membrane in composition and by accumulation of ECM containing fibrillar type I collagen. Although more than one potential source of ECM exist, the largest part of connective tissue components is synthesized by activated hepatic stellate cells (HSC). Hepatic stellate cells are located in the space of Disse between endothelial cells and parenchymal cells and their main function is the uptake and storage of vitamin A and other retinoids. Inducing or accelerating their apoptosis is a potential way of liver fibrosis treatment. Aim of our study was to find out how collagen gell influences HSC as the effect of ECM on HSC apoptosis has not been studied yet. We have used gel made of type I collagen, the main component of fibrotic liver ECM, to study how it affects spontaneous apoptosis of HSC isolated from carbon tetrachloride damaged liver and the apoptosis of normal HSC exposed to apoptosis inducing agents, gliotoxin, cycloheximide and cytochalasin D, in vitro. HSC were prepared by perfusion of rat normal and cirrhotic liver with pronase and collagenase solutions, followed by centrifugation of the cell suspension on a density gradient. HSC were cultivated on plastic dishes or collagen gel for 6 days. We observed three different types of HSC – quiescent, activated in vivo and vitro, and examined their growth, proliferation, activation and mainly apoptosis. We used imunocytochemical detection of α- SMA and apoptotic proteins Bcl-2 family. Also oligo cDNA array for determination of gene expression was used. Two independent methods were used to determine apoptosis, it was quantified by a specific staining of cell nuclei and by flow cytometry. HSC from normal liver were quiescent, but they became activated after plating on plastic dishes and on collagen gel. Collagen gel influenced morfology of HSC, their proliferation and apoptosis. HSC cultured on gel resembled star-shape cells observed in vivo. Activated HSC α-SMA positive that is responsible for cell contractile features. α-SMA partially dissappear with prolonged time of cultivation on gel which supports the thesis that activated HSCs may revert back to quiescence. Part of activated HSC underwent spontaneous apoptosis in vivo and in vitro. We have found that type I collagen enhances HSC apoptosis regardless of the agent triggering this process. Apoptotic rate in the cells on collagen was significantly higher when compared to the cells on plastic. Enhancing this process could lead to a more rapid resolution of liver fibrosis. Excessive deposition of ECM, especially of collagen I, may influence morphology, function and fate of HSC as shown by cultivation of these cells on collagen gel.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lenka Bittnerová, Ph.D. 2.36 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lenka Bittnerová, Ph.D. 55 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lenka Bittnerová, Ph.D. 35 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Lenka Bittnerová, Ph.D. 944 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. 33 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Vladislav Krtek, CSc. 34 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 68 kB