velikost textu

Vliv extracelulární matrix na expresi genů jaterních myofibroblastů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Vliv extracelulární matrix na expresi genů jaterních myofibroblastů
Název v angličtině:
Influence of extracellular matrix environment on gene expression in liver myofibriloblasts
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Alena Mrkvicová, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Jiří Kanta, CSc.
Oponenti:
prof. MUDr. Jiří Ehrmann, CSc.
doc. RNDr. Radislav Sedláček, Ph.D.
Id práce:
106363
Fakulta:
Lékařská fakulta v Hradci Králové (LFHK)
Pracoviště:
Ústav lékařské biochemie (15-180)
Program studia:
Lékařská chemie a biochemie (P5120)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
27. 6. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
SOUHRN Jaterní hvězdicové buňky (HSC) a jaterní myofibroblasty (MF) jsou považovány za buňky odpovědné za syntézu extracelulární matrix (ECM). HSC a MF se liší lokalizací v jaterním lalůčku i expresí genů. HSC se nacházejí v Disseho prostoru, při poškození jater se aktivují, proliferují a přeměnují se na myofibroblastické buňky. MF jsou heterogenní skupina buněk, byly popsány portální pMF, septální sMF a interface iMF. V portobiliárním prostoru jaterního lalůčku se nacházejí pMF, které se aktivují při ischemii a městnání žluči; sMF se nacházejí uvnitř vazivových sept. Cílem naší práce bylo porovnat změny exprese genů, které provázejí aktivaci HSC in vitro se změnami odehrávajícími se v HSC při vzniku jaterní cirhózy v modelu toxického poškození jater. Expresi vybraných genů jsme sledovali pomocí oligo cDNA arrayí zahrnujících geny kódující proteiny, proteoglykany, cytokiny, růstové faktory a geny související s metabolismem pojiva – metaloproteinasy (MMP). Zajímali jsme se také o chování MF v trojrozměrném kultivačním prostředí – fibrinovém a kolagenním gelu, které lépe simuluje podmínky ve fibrotických játrech. Poškozená jaterní tkáň je nahrazována nejdříve plasmatickým fibrinem a posléze je nahrazena jizvou s převahou kolagenu. Chování a exprese genů MF v trojrozměrném kultivačním prostředí, nebyla dosud studována. HSC jsme vyizolovali z normálních a cirhotických jater potkanů po perfuzi pronasou a kolagenasou. HSC jsme kultivovali na plastu po dobu 2 a 7 dní, získali jsme tak HSC s odlišnými fenotypy – klidové, aktivované in vitro a in vivo. Ze zdravých i cirhotických jater jsme vykultivovali subpopulaci MF pasážováním primární kultury neparenchymových jaterních buněk. V HSC a MF jsme prokazovali imunocytochemickým barvením α -aktin hladkého svalu (α-SMA), desmin, vimentin a kyselý gliový fibrilární protein (GFAP). Expresi genů jsme měřili pomocí oligo cDNA arrayí a kvantitativní RT-PCR. Vybrané proteiny jsme prokazovali pomocí imunocytochemie. Měřili jsme také úbytek hmoty gelů během kultivace MF. HSC aktivované kultivací na plastu ve srovnání s klidovými HSC exprimovaly ve větší míře geny pro složky extracelulární matrix (kolageny typu I, III a V), perlekan, fibronektin a osteopontin. Naopak nižší exprese byla patrná především u metaloproteas. Exprese genů v HSC čerstvě izolovaných z cirhotických jater se blížila expresi genů v HSC z normálních jater aktivovaných kultivací na plastu. Nepozorovali jsme významné rozdíly mezi MF z normálních a cirhotických jater. Během kultivace HSC se mění spektrum cytoskeletálních bílkovin. HSC se od MF liší především expresí desminu. GFAP obsahují pouze klidové HSC izolované z normálních jater, zároveň tyto buňky neexprimují α-SMA, který je detekovatelný až u aktivovaných HSC. Přítomnost gelů měl vliv jak na morfologii, tak na expresi genů MF. Ovlivněna byla exprese cytokinů IL-6, TGF-β1, -β2, -β3, CTGF a metaloproteinas, matricelulárních proteinů trombospondinu-2 a osteopontinu. Zvýšila se exprese MMP-3, 9, 13 a 14, exprese inhibitoru aktivátoru plasminogenu se snížila. Změny v expresi byly výraznější u kolagenního gelu. MF měly schopnost solubilizovat až polovinu hmoty gelů. Srovnání MF a aktivovaných HSC naznačilo, že jde o dva typy buněk s různou funkcí. Nebyl nalezen rozdíl mezi MF z cirhotických a z normálních jater. Zjistili jsme, že jak fibrinový gel tak zejména gel tvořený kolagenem typu I podstatně ovlivňuje jak expresi genů v těchto buňkách, tak i jejich morfologii. Trojrozměrná matrix ovlivnila expresi matricelulárních proteinů jež zasahují do regulace procesu remodelování tkání, a způsobila významné posuny v expresi cytokinů spojených s fibrogenesí. V MF se zvýšila exprese metaloproteas, což se projevilo zvýšenou schopností MF solubilizovat gely, v nichž byly kultivovány.
Abstract v angličtině:
Influence of extracellular matrix environment on gene expression in liver myofibroblast (summary) Hepatic stellate cells (HSC) and liver myofibroblasts (MF) are two cell populations most likely responsible for the synthesis of majority of connective tissue components in fibrotic liver. They differ in their origin and location in the liver, and in the spectrum of genes they express. HSC are located in Disse spaces of normal rat liver around the sinusoids, in fibrotic liver they become activated, proliferate and they undergo transdifferentiation into myofibroblast-like cells. Myofibroblasts are heterogenous cell population that consists at least of portal pMF, septal sMF and interface iMF. pMF, which are adjacent to bile duct epithelia, may be a mediator of billiary type fibrosis. sMF are located within and along the collagenous septum in cirrhotic liver. Little is known about the expression of genes involved in connective tissue metabolism in MF cultured in fibrin or collagen gels that more closely resemble natural cell environment. Fibrin is deposited in liver at sites of injury and collagen type I forms a substantial part of fibrotic septa. In our study oligo cDNA array analysis was used to determine gene expression in quiescent HSC, activated HSC and MF isolated from both normal and CCl4-cirrhotic liver. The expression of genes coding for connective tissue proteins, proteoglycans, metalloproteinases and their inhibitors, growth factors and cellular markers was determined. We investigated the influence of extracellular matrix environment on gene expression in MF. HSC were prepared by perfusion of rat normal and cirrhotic liver with pronase and collagenase solutions, followed by centrifugation of the cell suspension on a density gradient. HSC from normal liver were quiescent 2 days after plating on plastic but they became activated after another 5 days in culture. When the culture was passaged 5times, its character changed profoundly as HSC were replaced by MF. Both cell subpopulation HSC and MF were stained for expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) and intermediate filament proteins vimentin, desmin and glial fibrillary acidic protein (GFAP) using immunocytochemisty. Expression of genes was studied oligo cDNA array, rt RT-PCR. Expression of some proteins was studied by immunofluorescence. The extent of gel digestion by the cells was measured. The pattern of gene expression changed during HSC activation, there were distinct differences between HSC and MF. Activated HSC express more collagen type I, III, IV, perlecan, fibronectin, ostepontin than freshly isolated HSC. Expression of metalloproteinases (MMP) decreases with activation. Gene expression of HSC isolated from cirrhotic liver resemble expression of HSC activated in vitro by cultivation on plastic dishes. There was no difference between normal MF and those isolated from the cirrhotic liver. The spectrum of cytoskeletal proteins was changing during cultivation of HSC. HSC differ from MF by presence of desmin. GFAP could be detected only in normal cells 2 days after their isolation. In contrast, α-SMA was absent from normal cells at this time but its expression was pronounced later. Embedding MF in collagen gel resulted in pronounced morphological changes of the cells. mRNA expression of a group of metalloproteinase (MMP-2, -3, -9, -13, - 14) increased, while that of plasminogen activator inhibitor decreased. Significant changes in the expression of cytokines IL-6, TGF-β1, -β2, -β3 and CTGF were found. The effects of fibrin gels on MF were milder than those of collagen. Protein expression paralleled changes in MMP mRNA. MF have the ability to solubilise about half of collagen gel body. We conclude that MF and HSC are distinct cell populations. There was no difference between normal MF and those isolated from the cirrhotic liver. We found that embedding of cells in fibrin and collagen gel affected cell morphology and gene expression. Expression of matricellular proteins and cytokines important in scar tissue formation changed. Elevated expression of MMPs resulted in solubilization of gelous matrix.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Alena Mrkvicová, Ph.D. 10.98 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Alena Mrkvicová, Ph.D. 57 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Alena Mrkvicová, Ph.D. 39 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Alena Mrkvicová, Ph.D. 546 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Jiří Ehrmann, CSc. 46 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Radislav Sedláček, Ph.D. 52 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 66 kB