velikost textu

Interaction of Proteins with Low-molecular Substances in vitro. Effect of Glycation, Substances of Plant Origin, and Combination of these Factors on Function and Spectral Properties of Selected Proteins.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Interaction of Proteins with Low-molecular Substances in vitro. Effect of Glycation, Substances of Plant Origin, and Combination of these Factors on Function and Spectral Properties of Selected Proteins.
Název v češtině:
Interakce proteinů s nízkomolekulárními látkami in vitro. Vliv glykace, látek přírodního původu a kombinace těchto faktorů na funkci a spektrální vlastnosti vybraných bílkovin
Typ:
Disertační práce
Autor:
Ing. Lucie Trnková, Ph.D.
Školitel:
prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Jiří Patočka, DrSc.
prof. Ing. Ivan Mikšík, DrSc.
Konzultant:
PharmDr. Iva Boušová, Ph.D.
Id práce:
104839
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra biochemických věd (16-16160)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Toxikologie přírodních látek (DTX4)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
4. 5. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Katedra biochemických věd Kandidát Ing. Lucie Trnková Školitel Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Název disertační práce Interakce proteinů s nízkomolekulárními látkami in vitro. Vliv glykace, látek přírodního původu a kombinace těchto faktorů na funkci a spektrální vlastnosti vybraných bílkovin. Rostlinné polyfenolické látky se přirozeně vyskytují v lidské stravě a vyznačují se řadou biologických a farmakologických vlastností. Mají schopnost reagovat s nejrůznějšími proteiny včetně enzymů. Velký význam má jejich interakce se sérovým albuminem, jehož jednou z nejvýznamnějších funkcí je vázání, přenos a ukládání řady endogenních a exogenních nízkomolekulárních látek v krevním řečišti. Jedním z cílů práce bylo prostudovat vztahy mezi chemickou strukturou a vazebnými afinitami dvou významných skupin polyfenolických látek, konkrétně hydroxyskořicových kyselin a katechinů (flavanolů), s molekulou sérového abuminu v in vitro modelech pomocí spektrálních (UV-Vis absorpční spektroskopie, metoda zhášení fluorescence) a elektroforetických (nativní a SDS PAGE) metod. Některé polyfenoly způsobily změny v konformaci proteinu a byly zaznamenány určité vztahy mezi jejich strukturou a zjištěnými vazebnými afinitami k sérovému albuminu. Mezi nejvýznamnější rostlinné polyfenolické látky patří katechiny (flavanoly) zeleného čaje. Byla studována možnost interakce těchto katechinů s enzymem ERp57 v in vitro modelu metodou zhášení fluorescence. Pro studování vlivu katechinů zeleného čaje na reduktasovou aktivitu enzymu ERp57 v in vitro modelu byla použita citlivá fluorescenční metoda využívající dieosinglutathiondisulfid jako fluorescenční sondu. Sonda vykazuje nízkou fluorescenci při vlnové délce excitace a emise 520 nm/545 nm, která významně vzroste po redukci disulfidové vazby, tedy v přítomnosti enzymu ERp57. Na základě získaných výsledků byl diskutován vztah mezi strukturou studovaných katechinů a jejich vazebnou afinitou, popř. jejich inhibičním účinkem na reduktasovou aktivitu ERp57. Alfa-dikarbonylové sloučeniny (např. methylglyoxal) vznikají během řady metabolických procesů a také neenzymovou glykací proteinů glukosou. Jsou považovány za důležité prekurzory vzniku AGEs in vivo. Methylglyoxal se snadno váže na aminoskupiny proteinů za tvorby kovalentních zesítěných agregátů (crosslinků) a reaktivních forem kyslíku (ROS). Tím přispívá ke vzniku a rozvoji různých onemocnění včetně diabetu mellitu a jeho pozdních komplikací. Rostlinné polyfenolické látky mohou snižovat tvorbu AGEs a tím zpomalovat proces neenzymové glykace různými mechanismy, např. vychytáváním reaktivních α- dikarbonylových sloučenin nebo ROS. Dalším cílem práce bylo studium vlivu katechinů zeleného čaje na neenzymovou glykaci sérového albuminu zprostředkovanou methylglyoxalem v modelech in vitro pomocí fluorescenčních metod pro stanovení množství celkových (“nespecifických”) AGEs (λex/λem = 330/410 nm) a argpyrimidinu jako specifického AGE (λex/λem = 320/380 nm). Antiglykační účinek studovaných katechinů závisel na jejich struktuře a koncentraci. Glutathion-S-transferasy (GSTs) představují skupinu enzymů, které katalyzují konjugaci redukovaného glutathionu s řadou hydrofobních látek. Jedná se o důležité enzymy v detoxikaci různých xenobiotik. V rámci této práce byl studován účinek methylglyoxalu na strukturní a katalytické vlastnosti rekombinantní cytosolické GST z Schistosoma japonicum v in vitro modelu pomocí spektroskopických (UV-Vis absorpční a fluorescenční spektroskopie) a elektroforetických (nativní PAGE, SDS PAGE/western blotting) metod. Bylo zjištěno, že methylglyoxal snižuje katalytickou aktivitu GST a způsobuje změny v náboji molekuly enzymu stejně tak jako změny v jeho struktuře (tj. změna konformace, tvorba AGEs a crosslinků) v závislosti na koncentraci.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate Ing. Lucie Trnková Supervisor Prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. Title of Doctoral Thesis Interaction of proteins with low-molecular substances in vitro. Effect of glycation, substances of plant origin, and combination of these factors on function and spectral properties of selected proteins. Plant polyphenolic compounds naturally occurring in human diet possess a wide range of biological and pharmacological properties. They can interact with various proteins including enzymes. Their interaction with serum albumin has a great significance because of its ability to bind, transport and store many endogenous and exogenous low-molecular compounds present in blood circulation. One of the objectives of this thesis was to study chemical structure-binding affinity relationships of two important groups of polyphenolic substances, namely hydroxycinnamic acids and catechins (flavanols), with the molecule of serum albumin in the in vitro models using spectroscopic (UV-Vis absorption spectroscopy, fluorescence quenching method) and electrophoretic (native and SDS PAGE) methods. Some polyphenols caused the changes in protein conformation and the relationships between their structures and obtained binding affinities to serum albumin were noticed. Green tea catechins (flavanols) represent one of the most important plant polyphenolic substances. Interaction between these compounds and ERp57 enzyme in the in vitro model has been studied by fluorescence quenching method. Effects of green tea catechins on disulfide reductase activity of ERp57 enzyme in the in vitro model was monitored by sensitive fluorescent assay using dieosin glutathione disulfide as a fluorescent probe. This probe displays low fluorescence at the excitation/emission wavelength of 520 nm/545 nm, respectively, which significantly increases on reduction of its disulfide bonds (i.e. the presence of ERp57). Relationships between structures of the studied catechins and their binding affinities or their inhibitory effects on reductase activity of ERp57 were discussed. Alpha-dicarbonyl compounds (e.g. methylglyoxal) are formed during various metabolic processes and also by non-enzymatic protein glycation by glucose. They are thought to be principal precursors in generation of AGEs in vivo. Methylglyoxal can readily react with amino groups of proteins to form covalent cross-links and reactive oxygen species (ROS). It contributes to the onset and progression of many human diseases including diabetes mellitus and its related complications. Plant polyphenolic compounds can reduce formation of AGEs and thus slow down the process of non-enzymatic glycation by different mechanisms such as trapping of reactive α-dicarbonyl compounds or ROS. Another aim of this thesis was to study the effects of green tea catechins on methylglyoxal-mediated non-enzymatic glycation of serum albumin in the in vitro models using fluorescence methods for determination of total (“non-specific”) AGEs (λex/λem = 330/410 nm) and argpyrimidine as specific AGE (λex/λem = 320/380 nm). Antiglycating activity of the studied catechins was dependent on their structure and concentration. Glutathione S-transferases (GSTs) represent a group of enzymes which catalyze conjugation of reduced glutathione to various hydrophobic compounds. They are important enzymes in detoxification of various xenobiotics. Effect of methylglyoxal on the structural and catalytic properties of GST from Schistosoma japonicum was investigated in the in vitro model using spectroscopic (UV-Vis absorption and fluorescence spectroscopy) and electrophoretic (native PAGE, SDS PAGE/western blotting) methods. It was found out that methylglyoxal reduced catalytic activity of GST and caused changes in the molecular charge of the enzyme as well as changes in its structure (i.e. conformational changes, formation of AGEs and cross-links) in dependence on the concentration.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Ing. Lucie Trnková, Ph.D. 10.13 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Ing. Lucie Trnková, Ph.D. 120 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Ing. Lucie Trnková, Ph.D. 111 kB
Stáhnout Posudek vedoucího prof. MUDr. Jaroslav Dršata, CSc. 136 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Jiří Patočka, DrSc. 168 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Ing. Ivan Mikšík, DrSc. 179 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Prof. RNDr. Luděk Jahodář, CSc. 124 kB