text size

Studium biologické aktivity alkaloidů izolovaných z Corydalis cava (Fumariaceae)

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Studium biologické aktivity alkaloidů izolovaných z Corydalis cava (Fumariaceae)
Titile (in english):
Study of biological activity of isolated alkaloids from Corydalis cava (Fumariaceae)
Type:
Dissertation
Author:
Mgr. Jakub Chlebek, Ph.D.
Supervisor:
Prof. RNDr. Lubomír Opletal, CSc.
Opponents:
Prof. RNDr. Pavel Drašar, DSc.
Prof. Ing. Kamil Kuča, Ph.D.
Thesis Id:
104797
Faculty:
Faculty of Pharmacy in Hradec Králové (FaF)
Department:
Department of Pharmaceutical Botany (16-16130)
Study programm:
Pharmacy (P5206)
Study branch:
Toxicology of Natural Products (DTX4)
Degree granted:
Ph.D.
Defence date:
28/08/2012
Defence result:
Pass
Language:
Czech
Abstract (in czech):
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické botaniky a ekologie Kandidát: Mgr. Jakub Chlebek Školitel: Doc. RNDr. Lubomír Opletal, CSc. Název disertační práce: Studium biologické aktivity alkaloidů izolovaných z Corydalis cava (Fumariaceae). Klíčová slova: Corydalis cava, isochinolinové alkaloidy, DPPH, AChE, BuChE, BACE1, IMER. Hlízy dymnivky duté byly vybrány na základě bio-guided spektrofotometrické Ellmanovy metody jako zdroj isochinolinových alkaloidů pro studium jejich vybraných biologických aktivit. Hlízy dymnivky duté byly extrahovány EtOH a sumární směs s terciárními alkaloidy (frakce A) byly separovány sloupcovou chromatografií na silikagelu použitím stupňovité eluce C6H14, CHCl3 a EtOH. Opakovaná sloupcová chromatografie, preparativní TLC a krystalizace vedly k izolaci 15 isochinolinových alkaloidů. Chemická struktura izolovaných sloučenin byla určena na základě spektroskopických technik a srovnáním s daty v literatuře. Izolované alkaloidy byly testovány na schopnost inhibovat erytrocytární AChE, sérovou BuChE (IC50), BACE1 a zhášet volné radikály (EC50). Cholinesterasová inhibiční aktivita byly určena in vitro modifikovanou spektrofotometrickou Ellmanovou methodou. (+)-Kanadalin inhiboval AChE i BuChE způsobem závislý na dávce s hodnotou IC50 = 20,1 ± 1,1 μM a 85,2 ± 3,2 μM. (+)-Kanadin byl nejúčinějším inhibitorem AChE (IC50 = 12,4 ± 0,9 μM), zatímco (±)-korykavidin a (+)-bulbokapnin byly efektivními inhibitory BuChE (IC50 = 46,2 ± 2,4 μM a 67,0 ± 2,1 μM). Další izolované alkaloidy byly považovány za neaktivní (IC50 > 100 μM). Zhášecí aktivita volných radikálů u izolovaných alkaloidů byla testována in vitro DPPH testem. Nejvyšší aktivitu této skupiny látek vykazovaly (–)-skulerin, (–)-sinoakutin a (+)- bulbokapnin (EC50 = 102 ± 6,2 µM, 209 ± 8,1 µM a 279 ± 16,7 µM). Další alkaloidy byly považovány za neaktivní (EC50 >1000 μM). BACE1 inhibiční aktivita izolovaných alkaloidů byla měřena 2 odlišnými metodami: FRET testem na mikrotitračních destičkách a hrBACE1-IMER testem. FRET assay byla prováděna na multijamkovém spektrofluorometru za použití substrátu M-2420 a Panvera substrátu. Fluorescenční signály byly detegovány u těchto substrátů při λex/λem = 320/405 nm a 544/590 nm. Panvera substrát byl použit u 4 alkaloidů, které fluorescenčně interferovaly se substrátem M-2420 při λem = 405 nm. hrBACE-IMER byl zapojen do HPLC system a pro chromatografickou analýzu byl používán substrát M-2420. Fluorescenční detektor byl nastaven na λex/λem = 320/405 nm. (–)-Korykavamin a (+)-korynolin vykazovaly BACE1 inhibiční aktivitu v obou metodách: ve FRET testu (IC50 = 41,16 µM a IC50 = 33,59 µM) i v hrBACE-IMER testu (IC50 = 1690 µM a IC50 = 59,07 µM). Ostatní sloučeniny byly neaktivní nebo nevykazovaly závislost mezi koncentrací látky a enzymovou inhibicí. Žádná z testovaných látek nemůže být považována jako lead structure pro BACE1 inhibici v porovnání s BACE1 standardním inhibitorem – inhibitorem IV (IC50 = 0,02 µM – FRET assay). Použití obou výše uvedených metod představuje vhodný přístup pro screening a určení BACE1 inhibiční aktivity testovaných sloučenin.
Abstract:
ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Botany and Ecology Candidate: Mgr. Jakub Chlebek Supervisor: Doc. RNDr. Lubomír Opletal, CSc. Title of Doctoral Thesis: Study of biological activity of isolated alkaloids from Corydalis cava (Fumariaceae). Key words: Corydalis cava, isoquinoline alkaloids, DPPH, AChE, BuChE, BACE1, IMER. Tubers of Corydalis cava were selected on the basis of bio-guided spectrophotometric Ellman´s method as a source of isoquinoline alkaloids for study of their selected biological activities. The tubers of Corydalis cava were extracted with ethanol and the mixture of summary tertiary alkaloids (fraction A) was fractionated in silica gel chromatography column using step gradient elution with hexane, chloroform and ethanol. Repeated column chromatography, preparative TLC and crystallization led to the isolation of fifteen isoquinoline alkaloids. The chemical structures of isolated compounds were determined on the basis of spectroscopic techniques and by comparison with literature data. Isolated alkaloids were tested on ability to inhibit AChE, serum BuChE (IC50), BACE1 and for its free-radical scavenging activity (EC50). The cholinesterase inhibitory activity was determined in vitro by modified spectrophotometric Ellman’s method. (+)-Canadaline inhibited AChE as well as BuChE in a dose-dependent manner with IC50 values 20.1 ± 1.1 μM and 85.2 ± 3.2 μM, respectively. (+)- Canadine with an IC50 value 12.4 ± 0.9 μM was the most potent inhibitor of acetylcholinesterase, whilst (±)-corycavidine and (+)-bulbocapnine were effective inhibitors of butyrylcholinesterase with IC50 values 46.2 ± 2.4 μM and 67.0 ± 2.1 μM, respectively. Other isolated alkaloids were considered inactive (IC50 > 100 μM). The free-radical scavenging activity of isolated alkaloids was tested in vitro by means of the DPPH test. The highest activity was exhibited by (–)-scoulerine, (–)-sinoacutine and (+)- bulbocapnine with EC50 values 102 ± 6.2 µM, 209 ± 8.1 µM and 279 ± 16.7 µM, respectively. Other isolated alkaloids were considered inactive (EC50 >1000 μM). BACE1 inhibitory activity of isolated alkaloids was measured by two different assays: multi-well plate format (FRET assay) and hrBACE1-IMER assay. FRET assay in solution studies was carried out on a multi-well spectrofluorimeter using M-2420 and Panvera substrates. The assay was performed by reading the fluorescence signal at λex/λem = 320/405 nm and 544/590 nm, respectively. Panvera substrate was used for four compounds which were found to interfere with substrate M-2420 at λ = 405 nm. The hrBACE-IMER was inserted into a HPLC system and chromatographic analyses were performed using substrate M-2420. Fluorescence detector was set at 320 and 405 nm for excitation and emission wavelengths, respectively. (–)-Corycavamine and (+)-corynoline established their BACE1 inhibitory activity in both FRET assay (IC50 = 41,16 µM and IC50 = 33,59 µM, respectively) and in the hrBACE-IMER assay (IC50 = 1690 µM and IC50 = 59,07 µM, respectively), other compounds were inactive or did not show a correlation between inhibitor concentration and enzyme inhibition. None of tested compounds can be considered as a good lead compound for BACE1 inhibition in comparison with BACE1 standard inhibitor IV (IC50 = 0.02 µM). Use of the above mentioned methods represents a suitable approach for the screening and determination of BACE1 inhibitory activity of tested compounds.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Jakub Chlebek, Ph.D. 2.77 MB
Download Abstract in czech Mgr. Jakub Chlebek, Ph.D. 235 kB
Download Abstract in english Mgr. Jakub Chlebek, Ph.D. 178 kB
Download Opponent's review Prof. RNDr. Pavel Drašar, DSc. 476 kB
Download Opponent's review Prof. Ing. Kamil Kuča, Ph.D. 502 kB
Download Defence's report Prof. RNDr. Luděk Jahodář, CSc. 126 kB
Download Errata Mgr. Jakub Chlebek, Ph.D. 179 kB