velikost textu

Regulation of mast cell activation at the level of the high-affinity IgE receptor and STIM1

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Regulation of mast cell activation at the level of the high-affinity IgE receptor and STIM1
Název v češtině:
Regulace aktivace žírných buněk na úrovni vysokoafinitního receptoru pro IgE a STIM1
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Viktor Bugajev, Ph.D.
Školitel:
doc. RNDr. Petr Dráber, DrSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D.
Ing. Jiří Hašek, CSc.
Id práce:
104466
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Imunologie (P1517)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
19. 6. 2013
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRACT (CZ) Tato disertační práce je zaměřena na dva důležité regulátory signalizace žírných buněk. Prvním z nich je komplex vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI), který se podílí na získaných (adaptivních) imunitních odpovědí a druhý je stromální interakční molekula 1 (STIM1), která monitoruje hladiny vápníku v endoplasmickém retikulu (ER) a po uvolnění Ca2+ z ER se podílí na otevření vápníkovým uvolněním aktivovaných vápníkových (CRAC) kanálů. I když je struktura FcεRI známá již mnoho let a byla popsána řada molekul asociovaných s tímto receptorem, přesný molekulární mechanismus zahájení a ukončení FcεRI signalizace zůstává nejasný. V této studii jsme vyhodnotili dosavadní poznatky o molekulárních mechanismech iniciace fosforylace FcεRI s důrazem na nově popsaný model, podle kterého vzájemné interakce mezi protein tyrosin fosfatázami (PTPs) a protein tyrosin kinázami (PTKs) nastaví práh tyrosinové fosforylace FcεRI (PTK-PTP interakční model). Dále jsme rozšířili poznatky týkající se topografie fosfatáz citlivých k oxidaci po stimulaci FcεRI v rámci klastrů transmembrálních adaptorových proteinů: T buňky neaktivující „linker“ (NTAL) a „linker“ aktivovaných T lymfocytů (LAT). Žírné buňky původem z kostní dřeně (BMMC) jsme použili jako modelový systém pro získání nových poznatků o vzájemné lokalizaci STIM1 s mikrotubulovými filamenty a pohybu STIM1 závislém na pohybu mikrotubulů, který reflektoval přímou komunikaci mezi STIM1 a proteinem sledujícím plus-konce mikrotubulů, EB1. Abychom určili, zda STIM1 reguluje organizaci mikrotubulů v závislosti na vápníku připravili jsme BMMCs se sníženou expresí STIM1. V souladu s očekáváním jsme zjistili, že buňky se sníženou expresí STIM1 mají po aktivaci narušenou vápníkovou signalizaci, a že de-novo reorganizace mikrotubulů byla inhibovaná. Překvapivě, v buňkách ovlivněných inhibitorem polymerace mikrotubulů (nocodazolem) nebyla narušena translokace STIM1 do oblastí přiblížení ER/plazmatické membrány a aktivace CRAC kanálů nebyla narušena. Vzájemná interakce mezi mikrotubuly a STIM1 byla detailně analyzována sledováním změn v reorganizaci mikrotubulů BMMCs po jejich aktivaci různými podněty (antigenem, thapsigarginem nebo pervanadátem). Aktivace buněk přisedlých přes fibronektin na podložní sklíčka vedla k tvorbě mikrotubulových výčnělků. Tento doposud neznámý fenotyp žírných buněk vyžadoval integrínovou kostimulaci. Přítomnost STIM1 ve výčnělcích naznačuje, že lokální vápníková signalizace může hrát roli při tvorbě mikrotubulových výběžků. Významné úsilí bylo také zaměřeno na přípravu nových monoklonálních a polyklonálních protilátek proti STIM1 a vývoji nových polymerázových řetězových reakčních (PCR) směsí vhodných pro amplifikaci DNA fragmentů z krve anebo GC-bohatých templátů. Výstupy z těchto projektů jsou buď komerčně dostupné produkty (anti-STIM1 monoklonální protilátka), nebo jsou v procesu přípravy pro komerční využití (nové kvantitativní PCR směsi).
Abstract v angličtině:
ABSTRACT (EN)  This thesis is focused on two important gate-keepers of mast cell signaling. The first is the complex of the high-affinity receptor for immunoglobulin E (IgE) (FcεRI) associated with Lck/Yes- related novel tyrosine kinase (Lyn), which is involved in acquired immune responses and the second is the stromal interaction molecule (STIM)1, which senses calcium levels in endoplasmic reticulum (ER) and upon depletion of ER Ca2+ stores participates in opening of the plasma membrane Ca2+ release- activated Ca2+ (CRAC) channels. Although the structure of FcεRI is known for many years and numerous molecules associated with the receptor have been described, the exact molecular mechanism of initiation and termination of the FcεRI signaling is elusive. Therefore, we evaluated the current knowledge on the molecular mechanisms of FcεRI phosphorylation with emphasis on the newly described model according to which cross-talk between protein tyrosine phosphatases (PTPs) and protein tyrosine kinases (PTKs) sets the threshold for FcεRI tyrosine phosphorylation (PTK-PTP interplay model). Furthermore, we extended the knowledge about topography of active phosphatases which are prone to oxidation within the clusters of transmembrane adaptor proteins non-T cell activation linker (NTAL) and linker for activation of T cells (LAT) upon FcεRI triggering. Using bone marrow-derived mast cells BMMCs as a model, we obtained new data on colocalization of STIM1 with microtubule filaments and movement of STIM1 in microtubule- dependent manner that reflected direct communication between STIM1 and microtubule plus-end tracking protein EB1. To determine whether STIM1 regulates EB1 movement and microtubules organization in calcium dependent manner we prepared BMMCs with reduced expression of STIM1. We found, as expected, that STIM1-deficient cells exhibited impaired calcium signaling upon activation and that this resulted in inhibition of de-novo reorganization of microtubules. Unexpectedly, treatment of BMMCs with the inhibitor of microtubules polymerization (nocodazole) failed to impaire translocation of STIM1 to ER/plasma membrane junctions and CRAC channels function. The cross- talk between microtubules and STIM1 was analyzed in detail by recording changes in reorganization of microtubules in BMMCs attached on fibronectin-coated slides after their activation with different stimuli (antigen, thapsigargin or pervanadate). BMMCs activated by all activators employed showed formation of distinct microtubule protrusions. This hitherto unknown mast cell function required co- stimulatory signaling from integrins. STIM1 was localized in the plasma membrane protrusions suggesting that local calcium signaling plays a role in formation of such protrusions. Significant effort was also directed towards production of new monoclonal and polyclonal antibodies toward STIM1 and development of new real-time polymerase chain reaction (PCR) master mixes suitable for amplification of DNA fragments from whole blood and/or GC-rich templates. Outputs from these projects are either commercially available products (anti-STIM1 monoclonal antibody) or are in the processing for commercial use [new quantitative PCR (qPCR) master mixes].
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Viktor Bugajev, Ph.D. 7.47 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Viktor Bugajev, Ph.D. 63 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Viktor Bugajev, Ph.D. 24 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 266 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Jiří Hašek, CSc. 90 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 732 kB