velikost textu

Vliv polyfenolických látek s železo chelatační aktivitou u modelu akutního infarktu myokardu a oxidačního stresu navozeného katecholaminy

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Vliv polyfenolických látek s železo chelatační aktivitou u modelu akutního infarktu myokardu a oxidačního stresu navozeného katecholaminy
Název v angličtině:
Influence of Polyphenolic Substances with Iron Chelating Activity in Model of Acute Myocardial Infarction and Oxidation Stress Induced by Catecholamines
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Libuše Zatloukalová, Ph.D.
Školitel:
Prof.MUDr. Radomír Hrdina, CSc.
Oponenti:
Doc. MUDr. Ivan Tilšer, CSc.
prof. RNDr. Jiří Patočka, DrSc.
Konzultant:
PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D.
Id práce:
104343
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmakologie a toxikologie (DFX4)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
29. 2. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Farmakologie a Toxikologie Kandidát Mgr. Libuše Zatloukalová Školitel Prof. MUDr. Radomír Hrdina, CSc. Název disertační práce Vliv polyfenolických látek s železo chelatační aktivitou u modelu akutního infarktu mykardu a oxidačního stresu navozeného katecholaminy Úvod a cíl studie: Ischemická choroba srdeční (ICHS) a speciálně její nejvážnější forma akutní infarkt myokardu (AIM) představuje významný zdravotní problém v rozvinutých zemích s relativně vysokou mortalitou. V rámci multifaktoriální patogeneze AIM zaujímají významné místo reaktivní formy kyslíku a dusíku (RONS) tvořené za katalytického působení volného železa, vystupňovaná aktivita sympatického nervového systému a uvolňování katecholaminů. Proto je jako vhodný model AIM používán syntetický katecholamin isoprenalin (ISO), který navozuje morfologické a funkční změny podobné těm, které provázejí AIM u lidí. AIM je považován za typickou formu ischemicko-reperfuzního (I-R) poškození myokardu. Významnou roli v něm hrají RONS, které se v nadměrné míře uvolní během prvních minut reperfuze. Volné železo celý proces tvorby RONS velmi významně stupňuje. Využití chelátorů železa by mělo mít protektivní vliv na I-R a AIM, jak vyplývá ze zmíněné patogeneze. Chelátory železa představují rozsáhlou skupinu léčiv s velmi variabilní strukturou. Klinicky jsou využívané v případech akutního předávkování železem a chronického přesycení železem spojeného především s častým podáváním krevních transfuzí zejména u pacientů s talasemií. Tyto látky jsou ovšem experimentálně zkoumány v řadě jiných indikací. Cíl této studie byl tudíž zaměřen na látky s potenciálem chelatovat železo, které přispívá k rozvoji oxidačního stresu myokardu. Prostřednictvím in vitro metody jsme porovnali železo-chelatační účinky testovaných polyfenolických látek při pato/fyziologických pH podmínkách, jejich vztah ke struktuře a srovnali jsme jejich účinky se standardním chelátorem deferoxaminem. Druhou část disertační práce jsme věnovali in vivo analýze účinků látek s železo-chelatačním potenciálem na katecholaminovém modelu AIM navozeném vysokými dávkami ISO. Metodika: V in vitro studiích byla analyzována chelatační aktivita a stabilita utvořených komplexů u 26 flavonoidů z různých skupin a řady přirozeně se vyskytujících a chemicky syntetizovaných 4-metylkumarinů, a to za různých pato/fyziologických pH podmínek (4,5/5,5/6,8/7,5), ve srovnání s klinicky užívaným chelátorem železa deferoxaminem. Chelatace železnatých iontů a celkového železa byla zkoumána pomocí jednoduché spektrofotometrické zkoušky. Chelátory železa byly smíchány s železnatými nebo železitými ionty v různých koncentračních poměrech. Koncentrace nevázaného železa byla poté určena specifickým indikátorem železnatých iontů ferrozinem při vlnové délce 562 nm. Absorbance byla měřena ihned po přidání ferrozinu a po 5 minutách. Stanovení železitých iontů probíhá nepřímo, pomocí jejich redukce hydroxylaminem na železnaté, které jsou následně stanoveny ferrozinem. Tímto nepřímým způsobem je stanovena i chelatace celkového železa. V in vivo experimentech byli použiti samci potkanů kmene Han:Wistar o průměrné hmotnosti 360 g. Potkani byli premedikováni i.v. flavonoidem rutinem (46 mg.kg-1 a 11,5 mg.kg-1) nebo standardním chelátorem železa dexrazoxanem (20,4 mg.kg-1) (DEX) samotným nebo v kombinaci s ISO (100 mg.kg-1) podaným s.c. Za 24 hodin po aplikaci léčiv byla zvířata anestezována za pomocí uretanu (1,2 g.kg-1 i.p.). Hemodynamické parametry srdeční funkce byly změřeny prostřednictvím termodiluční metody za použití přístroje Cardiosys (Experimetria Ltd., Maďarsko). V případě DEX se provádělo ještě kontinuální 2-hodinové měření hemodynamických parametrů srdeční funkce a EKG parametrů pomocí přístroje PowerLab (AdInstruments, Austrálie). Krevní vzorek byl odebrán pro stanovení biochemických markerů. Po eutanazii potkanů i.v. podáním KCl (1 mM) bylo srdce vyjmuto pro zvážení srdečních komor, analýzu vybraných iontů a histopatologické vyšetření. Výsledky: In vitro studie poukázala, že nejúčinnější železo-chelatační místo flavonoidů představuje 6,7- dihydroxy struktura, jako v případě baikaleinu, který prokázal stejnou aktivitu ve všech testovaných pH jako deferoxamin. Významnou železo-chelatační aktivitu mají také flavonoidy s 3-hydroxy-4-keto uspořádáním spolu s 2,3-dvojnou vaznou a katecholickým B kruhem, např. myricetin a quercetin, ale nemají významnou roli v kyselejším prostředí, podobnou aktivitu jako baikalein a deferoxamin měli pouze za neutrálních podmínek. 5-hydroxy-4-keto uspořádání bylo méně aktivní a samotné keto, hydroxy, metoxyskupiny nebo ortho-metoxy-hydroxyskupiny nebyly spojeny s chelatací železa. Mezi testovanými kumariny byly nejúčinnějšími chelátory železa orto-dihydroxyderiváty. 7,8- dihydroxy-4-metylkumariny dosáhly za neutrálního pH účinnosti deferoxaminu, ovšem nevázaly železo dostatečně pevně za kyselých podmínek, navíc redukovaly železité ionty, čímž by mohly vést k zesílení Fentonovy reakce a tím i oxidačního stresu. Ostatní kumariny významně železo nechelatovaly, s výjimkou orto-diacetoxykumarinů. V in vivo studii bylo podání ISO ve srovnání s kontrolou spojeno s 30% mortalitou, poklesem tlaku krve, snížením srdečního výdeje, zvýšením periferní cévní rezistence a srdeční frekvence, uvolněním srdečního troponinu T (cTnT) do cirkulace, vzestupem vlhké hmotnosti komor, přesycením myokardu vápníkem a histopatologickými abnormalitami. V případě EKG ISO vedl k rychlému zvýšení ST segmentu a snížení amplitudy T vlny a R vlny. Rutin snížil vzestup periferní cévní rezistence po podání ISO, ale obecně spíše zhoršoval katecholaminové poškození myokardu. Vyšší dávka zvýšila mortalitu, potencovala uvolnění cTnT a zvýšila přesycení myokardu vápníkem. DEX snížil úmrtnost potkanů především pravděpodobně díky útlumu dysrytmií a inhibici přebytku vápníku. Ačkoliv měl DEX tendenci snižovat střední tlak krve, neměl žádný významný vliv na ostatní hemodynamické a EKG parametry. Závěr: Schopnost jednotlivých látek chelatovat železo závisí na jejich chemické struktuře a prostředí. Užití některých železo-chelatačních flavonoidů či 4-metylkumarinů může být totiž nevhodné především v kyselém prostředí (jako je tomu u akutního infarktu myokardu) v důsledku redukce železitých iontů a následné účasti železnatých iontů ve Fentonově reakci a zvýšené produkci volných radikálů kyslíku a dusíku. V případě in vivo účinků rutin nebyl schopen snížit katecholaminovou kardiotoxicitu pravděpodobně díky jeho hydrofilnímu charakteru a pro-oxidačním vlastnostem. Naopak toto myokardiální poškození ve vyšších dávkách spíše zhoršoval. DEX prokázal některé kardioprotektivní účinky u modelu AIM, ty byly ale pravděpodobně většinou způsobené antidysrytmickým působením díky chelataci železa a inhibici přesycení myokardu vápníkem.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate Mgr. Libuše Zatloukalová Supervisor Prof. MUDr. Radomír Hrdina, CSc. Title of Doctoral Thesis Influence of polyphenolic substances with iron chelating activity in model of acute myocardial infarction and oxidation stress induced by catecholamines Background and aim: Ischaemic heart disease (IHD) and particularly its most serious form - acute myocardial infarction (AMI) - represents significant health problem in the developed countries with relatively high mortality. Within multifactorial pathogenesis of AMI, reactive oxygen and nitrogen species (RONS) generated by free iron catalytic effect and increased activity of the sympathetic nervous system accompanied with a release of the catecholamines play a significant role. Large doses of the synthetic katecholamine isoprenaline has been used as a suitable experimental model of AMI. AIM is considered as typical form of ischaemic-reperfusion (I-R) injury. RONS, which are excessively released during the first minutes of reperfusion, play a significant role in the pathogenesis of myocardial I-R injury. Free iron significantly increases the process of RONS generation. Use of iron chelators could have protective influence in I-R injury and AMI, which is obvious from the mentioned pathogenesis. Iron chelators represent large group of drugs with very variable chemical structure. In clinical practice they are used in cases of acute iron overdose and in chronic iron overload accompanying mainly frequent blood transfusions in patients with thalassaemia. These substances are experimentally studied also in another pathological conditions. Aim of this study was therefore focused on substances with iron chelation potential. By in vitro method we compared iron-chelating activity of the tested polyphenolic substances in different patho/physiological pH conditions, their relation to the structure. Their chelating activity was compared with the standard chelating agent deferoxamine. The last part of the doctoral thesis deals with in vivo analysis of the effects of iron chelating substances in catecholamine model of AMI, induced by the administration of high dose of ISO. Methods: In in vitro studies, 26 flavonoids from different subclasses and a series of naturally and synthetic 4- methylcoumarins were analysed for their iron chelating activity and stability of the formed complexes in four patho/physiologically relevant pH conditions (4.5/5.5/6.8/7.5) and compared with clinically used iron chelator deferoxamine. Ferrous ions and total iron chelating activity was assessed by a simple spectrophotometric assay. Iron chelators were mixed with ferrous or ferric ions in various ratios. Concentration of free iron was measured by specific indicator of ferrous ions ferrozine at 562 nm. Absorbance was measured immediately after addition of ferrozine and 5 minutes later. Concentrations of ferric ions is determined indirectly by means of ferric ions reduction by hydroxylamine to ferrous ions, which are subsequently determined by ferrozine. By this indirect method, the total iron chelation has been assessed too. In in vivo experiments we used male Han:Wistar rats weighing approximately 360 g. Rats were pretreated i.v. with flavonoid rutin (46 mg.kg-1 and 11,5 mg.kg-1) or with standard iron chelator dexrazoxane (20,4 mg.kg-1) (DEX) alone or in combination with ISO (100 mg.kg-1 s.c.). 24 hours after drug(s) administration, animals were anaesthetized with uretane (1,2 g.kg-1 i.p.). Haemodynamic parameters of cardiac function were assessed by thermodilution method using Cardiosys (Experimetria Ltd., Maďarsko). In the case of DEX, continual 2-hours measurements of haemodynamic and ECG parameters using apparatus PowerLab (AdInstruments, Austrálie) were performed. Blood sample was withdrawn for biochemical measurement. Following euthanasia (1 mM KCl i.v.), the heart ventricles were removed for the measurement of their wet weight, concentration of the selected elements and for histopathological analysis. Results: In vitro study demonstrated that the most effective iron binding site of flavonoids represents 6,7- dihydroxy structure, as in the case of baicalein, which had the similar activity in all tested pH as compared to deferoxamine. The 3-hydroxy-4-keto conformation together with 2,3-double bond and catecholic B ring, for example myricetin and quercetin, were also associated with a substantial iron chelation, but they have no significant role in the acidic conditions. They have similar activity like baicalein and deferoxamine only in the neutral conditions. The 5-hydroxy-4-keto site was less efficient and isolated keto, hydroxyl, methoxyl groups or an ortho-methoxy-hydroxyl groups were not associated with iron chelation. Among the tested coumarins, ortho-dihydroxyderivatives were the most potent iron chelators. 7,8- dihydroxy-4-methylcoumarins reached the efficacy of deferoxamine in neutral pH, but they did not bind iron firmly in acidic conditions. In addition, they reduced ferric ions to ferrous ones, which could lead to intensification of the Fenton chemistry. Other tested coumarins did not substantially chelate iron with exception of ortho-diacetoxycoumarins. In in vivo study, ISO alone caused 30% mortality, a decrease in blood presure, cardiac output, total peripheral resistance and an increase in heart rate, marked elevation of cardiac troponin T concentration, wet ventricle weight increase, myocardial calcium overload and histopathological abnormalities. Regarding ECG parameters, ISO caused rapid elevation in ST junction and a depression in T-wave and R-wave amplitudes. Rutin decreased peripheral resistance elevation following ISO administration, but generally, rutin rather aggravated catecholamine myocardial injury. Higher dose of rutin increased mortality, intensified an increase in serum cTnT concentration and increased calcium overload in myocardium. DEX decreased mortality likely due to an attenuation of dysrhythmias and inhibition of myocardial calcium overload. Although DEX tended to insignificantly decrease mean blood pressure, it had no significant influence on other haemodynamic and ECG parameters. Conclusion: Ability of particular substances to chelate iron depends on their chemical structure and pH conditions. Using of some iron-chelating flavonoids or 4-methylcoumarins could be unsuitable mainly in acidic conditions (e.g., in acute myocardial infarction), as a consequence of ferric ions reduction and subsequent participation of ferrous ions in Fenton chemistry. In the case of in vivo effects, rutin was not able to decrease catecholamine cardiotoxicity, probably due to its hydrophilic character and pro-oxidant properties. Contrarily, rutin in higher dose rather aggravated this myocardial injury. DEX demonstrated some cardioprotective effects in a model of AMI, which were probably caused, at least partly, by antidysrhytmic activity due to iron chelation and partial prevention of calcium overload of the myocardial tissue.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Libuše Zatloukalová, Ph.D. 1.5 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Libuše Zatloukalová, Ph.D. 88 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Libuše Zatloukalová, Ph.D. 57 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Prof.MUDr. Radomír Hrdina, CSc. 196 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. MUDr. Ivan Tilšer, CSc. 468 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Jiří Patočka, DrSc. 171 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Doc. PharmDr. František Trejtnar, CSc. 130 kB