velikost textu

Hodnocení poškození a reparace DNA u pacientů s nemalobuněčným plicním karcinomem vzhledem k farmakoterapii deriváty platiny

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Hodnocení poškození a reparace DNA u pacientů s nemalobuněčným plicním karcinomem vzhledem k farmakoterapii deriváty platiny
Název v angličtině:
Evalution of DNA Damage and Repair in patients with Non-small Cell Lung Cancer Due to Drug Therapy with Platinum Derivatives
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Petra Fikrová, Ph.D.
Školitel:
Doc. PharmDr. Miloslav Hronek, Ph.D.
Oponenti:
Doc.MUDr. Josef Herink, DrSc.
Prof. RNDr. Mária Dušinská, Ph.D.
Konzultant:
prof. RNDr. Rudolf Štětina, CSc.
Id práce:
104320
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra biologických a lékařských věd (16-16150)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmakologie a toxikologie (DFX4)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
12. 12. 2013
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Kandidát: Mgr. Petra Fikrová Školitel: Doc. PharmDr. Miloslav Hronek, Ph.D. Konzultant: Prof. RNDr. Rudolf Štětina, CSc. Název disertační práce: Hodnocení poškození a reparace DNA u pacientů s nemalobuněčným plicním karcinomem vzhledem k farmakoterapii deriváty platiny Rakovina plic je nejčastější celosvětovou příčinou úmrtí spojeného s rakovinou. Tento typ rakoviny je rozdělován do dvou podtypů a to malobuněčného a nemalobuněčného plicního karcinomu. Chemoterapie deriváty platiny je základním kamenem léčby pokročilých stádií nemalobuněčného plicního karcinomu, kterému je tato práce věnována. Cílem této práce bylo zjistit, zda-li je možné využít metodu kometového testu pro monitorování průběhu léčby u těchto pacientů a jestli jsme schopni předpovídat pacientovu odpověď na léčbu či případně i přežití pacienta. Pro měření poškození jsme tedy používali základní verzi kometového testu či jeho modifikaci pro měření oxidačního poškození DNA a námi validovanou modifikaci pro měření křížových vazeb v DNA. Tato hodnocení probíhala buď in vitro na HeLa buňkách a periferních lymfocytech od zdravých dárců z Transfuzní stanice Fakultní nemocnice v Hradci Králové, nebo v rámci studie v periferních lymfocytech pacientů trpících nemalobuněčným plicním karcinomem, kteří jsou léčeni deriváty platiny na onkologickém stacionáři plicní kliniky Fakultní nemocnice v Hradci Králové. Oxidační poškození DNA jsme dále proměřovali pomocí ELISA, kdy jsme hodnotili hladinu 8-OHdG v moči. Nejprve jsme validovali metodu kometového testu pro měření křížových vazeb v DNA za použití mutagenu styrenoxidu, který vytváří zlomy v DNA. Metoda byla kalibrována v in vitro podmínkách na HeLa buňkách a lidských lymfocytech od zdravých dárců. Prokázali jsme, že jsme schopni pomocí této metody v DNA detekovat na dávce cisplatiny závislou tvorbu křížových vazeb. Výsledky následně byly ověřeny i v in vivo podmínkách, kdy jsme zjistili, že i přes výrazné inter-individuální rozdíly, jsme schopni u pacientů detekovat změny v tvorbě a reparaci křížových vazeb v průběhu chemoterapeutické léčby. V další části jsme hodnotili poškození a reparaci DNA pomocí měření jednořetězcových zlomů, křížových vazeb a změn v hladinách reparačních kapacit (bázové a nukleotidové excizní reparace) v průběhu chemoterapie. Navíc jsme se pak ještě zaměřili na změny hladin oxidačního poškození v průběhu chemoterapie. Hodnoty poškození a reparace pacientů jsme také porovnávali k hodnotám věkově odpovídajících zdravých jedinců. Při porovnání pacientů a kontrol jsme zjistili zejména signifikantně vyšší hladinu bázové excizní reparace u kontrolní skupiny, zatímco hladina nukleotidové excizní reparace byla u obou skupin v podstatě stejná. U pacientů v průběhu léčby jsme pak zjistili signifikantně vyšší hladiny jednořetězcových zlomů v DNA při měření hned po podání chemoterapeutické dávky v rámci jednotlivých cyklů chemoterapie. Podobné výsledky jsme dostali i při měření křížových vazeb, tedy že největší procento křížových vazeb v DNA nalezneme hned po dokapání chemoterapeutické dávky nebo jeden den po podání této dávky. Zjistili jsme také, že počet jednořetězcových zlomů narůstá v průběhu celé chemoterapie (i když nesignifiakntně) a že po skončení celé chemoterapie (všech cyklů) můžeme v DNA najít residuální křížové vazby, které tam perzistují. Dále jsme porovnali vstupní hodnoty reparačních kapacit u pacientů, kteří absolvovali celou chemoterapii, a u pacientů, kteří v průběhu ní zemřeli. Dostali jsme podobné výsledky jako v případě porovnání skupiny pacientů a kontrol, tedy že ačkoli hladina nukleotidové reparace byla u obou skupin téměř stejná, hladina bázové excizní reparace byla v případě skupiny pacientů, kteří absolvovali celou chemoterapii, vyšší. Data z naší pilotní studie potvrzují, že lze pomocí modifikovaného kometového testu užitím mutagenu styrenoxidu monitorovat změny v tvorbě a reparaci křížových vazeb in vitro a také u pacientů v průběhu chemoterapeutické léčby. Dále jsme potvrdili výsledky jiných studií, zabývajících se poškozením DNA při maligním onemocnění, jeho následné léčbě a spojitosti nedostatečné účinnosti bázové excizní reparace jako rizikového faktoru těchto onemocnění. Navíc naše výsledky naznačují, že ačkoli je cisplatina z DNA odstraňována nukeotiodvou excizní reparací, bázová excizní reparace hraje v klinickém stavu pacienta a v jeho přežití také velmi významnou roli.
Abstract v angličtině:
Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Mgr. Petra Fikrová Supervisor: Doc. PharmDr. Miloslav Hronek, Ph.D. Consultant: Prof. RNDr. Rudolf Štětina, CSc. Title of doctoral thesis: Evaluation of DNA damage and repair in patients with non-small cell lung cancer due to drug therapy with platinum derivatives Lung cancer is the most common worldwide cause of cancer-related death. This type of cancer is divided into two subtypes, the small cell and non-small cell lung cancer. Platinum- based chemotherapy is the mainstay of treatment of advanced stages non-small cell lung cancer, to that is this work focused on. The aim of this study was to investigate whether it is possible to use the comet assay method for monitoring the progress of treatment in these patients, and if it is possible to predict a patient's response to treatment or patient's survival. Standard version or modifications of comet assay were used for the measurement of DNA damage or oxidative DNA damage and we also validated a modification of comet assay for measuring DNA crosslinks. This evaluation was carried out either in vitro in HeLa cells and in peripheral blood lymphocytes from healthy donors from Transfusion department of University Hospital in Hradec Kralove and also in peripheral lymphocytes of patients with non-small cell lung cancer treated with platinum derivatives in the Pulmonary department in University Hospital in Hradec Kralove. Oxidative damage to DNA were also measured by ELISA where we evaluated the level of 8-OHdG in urine of patients. At first we validated the comet assay method for the measurement of DNA crosslinks using a mutagen styrene oxide as a DNA breaking agent. The method was calibrated in in vitro conditions on HeLa cells and human lymphocytes from healthy donors. We have demonstrated that we are able to use this method to detect a cisplatin dose-dependent formation of DNA crosslinks. The results were subsequently verified in in vivo conditions in which we found that despite the considerable inter-individual differences, we are able to detect changes in induction and repair of DNA crosslinks in patients during chemotherapy. Further we evaluated DNA damage and repair by measuring single-strand breaks, DNA crosslinks and changes in the levels of DNA repair capacity (base and nucleotide excision repair) during chemotherapy. Then we focused on changes in levels of oxidative DNA damage during chemotherapy. We also compared input values of DNA damage and repair of patients and values of age-corresponding healthy controls. When comparing patients and controls, level of base excision repair was significantly higher in the control group, while the level of nucleotide excision repair in both groups was essentially the same. We found a significantly higher level of single-strand breaks immediately after administration of chemotherapy. Similarly, we found the highest incidence of DNA crosslinks immediately or one day after chemotherapy. We also found that the number of single-strand breaks increases throughout the chemotherapy (although nonsignificantly) and we can also find residual DNA crosslinks that persist in DNA even after the whole chemotherapy. We also compared the input values of repair capacity in patients who finished a whole chemotherapy and patients who died during it. We got similar results when comparing groups of patients and controls. However, the level of base excision repair was higher in the group of patients who finished a whole chemotherapy, while the level of nucleotide excision repair in both groups was essentially the same. Data from our pilot study indicate that it is possible to use a modified comet assay for monitoring changes in the formation and repair of DNA crosslinks in vitro and in patients during chemotherapy treatment. Furthermore, we confirmed the results of other studies dealing with DNA damage during the treatment of malignant diseases and the connection of the lack of base excision repair efficacy as a risk factor for these diseases. Moreover, our results suggest that although cisplatin is removed from the DNA by nucleotide excision repair, base excision repair plays also a very important role in the clinical condition of the patient and his survival.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Petra Fikrová, Ph.D. 7.12 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Petra Fikrová, Ph.D. 211 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Petra Fikrová, Ph.D. 153 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc. PharmDr. Miloslav Hronek, Ph.D. 202 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc.MUDr. Josef Herink, DrSc. 218 kB
Stáhnout Posudek oponenta Prof. RNDr. Mária Dušinská, Ph.D. 863 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Prof.MUDr. Radomír Hrdina, CSc. 524 kB