velikost textu

Studium interakce nově vyvíjených radiofarmak s biologickým systémem na buněčné úrovni

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium interakce nově vyvíjených radiofarmak s biologickým systémem na buněčné úrovni
Název v angličtině:
The Study of Receptor-specific Radiopharmaceuticals Interactions with Biological Systems at the Cellular Level
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Pavel Bárta, Ph.D.
Školitel:
Prof.PharmDr.Ing. Milan Lázníček, CSc.
Oponenti:
Doc. PharmDr. Petr Nachtigal, Ph.D.
prof. RNDr. Rudolf Štětina, CSc.
Konzultant:
Doc. PharmDr. František Trejtnar, CSc.
Id práce:
104314
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmakologie a toxikologie (DFX4)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
18. 9. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Farmakologie a toxikologie Kandidát Mgr. Pavel Bárta Školitel Prof. PharmDr. Ing Milan Lázníček, CSc. Název disertační práce Studium interakce receptorově specifických radiofarmak s biologickým systémem na buněčné úrovni Cílení nádorových buněk receptorově specifickými peptidy nebo protilátkami patří k významnému diagnostickému a někdy i terapeutickému nástroji v boji proti nádorovým onemocněním. Receptorově specifické peptidy jsou především odvozené od tělu vlastních peptidových hormonů, proto o nich mluvíme jako o peptidových analozích. Analogy peptidů obsahují ve svém peptidovém řetězci vazebné místo shodné s přirozeným peptidem umožňující jejich specifické navázání na cílový receptor. Peptidové analogy se používají místo přirozených peptidů zejména z důvodu jejich lepších biologických vlastností usnadňujících jejich distribuci v organismu do místa jejich působení nebo z důvodu jejich ochrany před biologickou degradací. Vazba a internalizace peptidového ligandu do buňky většinou sama o sobě nenavozuje terapeutický efekt, proto peptidový analog nese aktivní látku jako je cytotoxin nebo radioizotop, která má terapeutický účinek anebo i diagnostický v případě radioaktivního izotopu. Terapeutický efekt radioizotopu pak zahrnuje poškození DNA nádorové buňky vedoucí ke ztrátě jejich proliferačních schopností a k zániku buňky. Vedle terapeutického efektu je častější použití radioaktivně značených peptidů pro zobrazovací účely. Zobrazovací schopnost gama záření emitujících izotopů usnadňuje nalezení ložiska nádoru. Terapeuticky využívané receptorově specifické monoklonální protilátky jsou schopné bránit přenosu signálu vzniklého z interakce přirozeného ligandu na cílovém receptoru tím, že blokují vazebná místa na receptorech. Terapeutický účinek také spočívá v zabránění přenosu signálu z receptoru na efektorové proteiny uvnitř buňky a tím vzniku buněčné odpovědi. Monoklonální protilátky nemusejí mít sami o sobě dostatečný terapeutický účinek, proto se častěji používají ve formě transportních látek pro cytotoxická léčiva nebo radionuklidy, které působí zánik cílených buněk. Radioaktivní značení monoklonálních protilátek má stejně jako u peptidových analogů i diagnostický účel. Nevýhodou protilátek bývá velikost jejich molekuly. Zatímco peptidy o krátkém peptidovém řetězci snadněji pronikají do místa působení, protilátky se jen pomalu distribuují a rychleji podléhají biodegradaci v játrech. Řešení této komplikace z posledních let spočívá ve vytvoření fragmentů protilátek, které se postupně „poskládají“ na cílové struktuře receptoru, mluví se o tzv. pre-targeting metodě. Vedle snadné distribuce v organismu se navíc snižuje riziko cytotoxické nebo radiologické zátěže pacienta. Cíl publikované práce v kapitole I byl zaměřen na případné ovlivnění biologických vlastností peptidu minigastrin11 (MG11) radioaktivním značením, kdy se testovala jeho schopnost interakce na specifickém cholecystokininovém receptoru typu 2 (CCK2r) a míra jeho internalizace do pankreatických nádorových buněk AR42J. Minigastrinový analog byl značen radionuklidy 177Lu a 111In, kdy prvně uvedený má v onkologii terapeutické využití a druhý diagnostické. Vazba komplexu 111In-DOTA-MG11 na receptor byla pomalá a nedosáhla rovnováhy mezi asociací a disociací reakce ligandu na receptoru ani po třech hodinách inkubace. Na druhou stranu, interakce komplexu 177Lu-DOTA-MG11 na CCK2r dosáhla rovnováhy po jedné hodině inkubace včetně vyššího internalizovaného podílu radiopeptidu z celkového přidaného množství, než tomu bylo v případě 111In-DOTA-MG11. Radiofarmakum 177Lu-DOTA-MG11 je tedy schopno se efektivně vázat na cílový CCK2r a má tak slibné předpoklady pro své uplatnění v terapii radionuklidem značenými receptorově specifickými peptidy (PRRT). Výše zmíněná radiofarmaka se použila i pro zjištění případné radionefrotoxicity, která bývá častou doprovodnou komplikací aplikace radioaktivně značených peptidových analogů. Komplikace s poškozováním ledvin v případě radioaktivně značených peptidů je zapříčiněna zpětnou tubulární resorpcí, která kumuluje radioaktivní izotopy v ledvinných buňkách proximálního tubulu. Pro otestování případné kumulace 111In- a 177Lu-ligandu se použila buněčná linie izolovaná z proximálního tubulu ledvin vačice oposum (OK buňky). Výsledky experimentu byly příznivé, neboť neprokázaly významnou kumulaci radioligandů v ledvinných buňkách. Internalizace radiopeptidů vykazovala maximálních hodnot kolem 0.1 % z celkově přidaného množství aktivního ligandu k buňkám. Publikace v kapitole II se zaměřila na zlepšení způsobu kvantifikace receptorů na buňkách (NRPC). Studie porovnala možnosti nabízené klasickou manuální technikou pro NRPC s novým způsobem kvantifikace receptorů na automatickém zařízení nesoucí název LigandTracer® určeného pro real-time měření interakce radioligandu s cílovým receptorem na buněčném povrchu. Nový způsob stanovení počtu receptorů dostal označení KEX metoda. Název je odvozen od základního principu metody, který spočívá v extrapolaci dat kinetické reakce vazby ligandu na receptor, tedy ve výpočtu teoretické hodnoty Bmax, která odpovídá signálu kompletně saturovaného množství cílených receptorů na povrchu buňky. Manuální metoda se řadí mezi techniky kvantifikace receptorů na povrchu buněk osvědčené mnohaletým užíváním a je tak zlatým standardem NRPC technik. Naměřené hodnoty kvantifikovaných receptorů manuální metodou a technikou KEX vykázaly shodu, pouze KEX technika v některých případech vykazovala mírné nadhodnocení počtu receptorů oproti klasické metodě. KEX technika se i přesto dá zařadit mezi metody umožňující kvantifikaci cílených buněčných receptorů s využitím v biologických vědách a s následným uplatněním v nukleární medicíně. Rychlé ověření množství receptorů a schopnosti radioligandu se vázat na zamýšlenou strukturu na povrchu nádorové buňky zefektivní výzkum nových terapeutických nebo diagnostických molekul pro onkologickou léčbu. Možný význam plynoucí z KEX techniky byl opakovaně ověřen i v další experimentální studii uvedené v kapitole V. Zde se porovnávaly hodnoty počtu receptorů na testovaných buněčných liniích měřených technikou KEX, klasickou manuální technikou a metodou western blottingu. Výsledek studie opětovně potvrdil uvedení KEX techniky mezi spolehlivé metody stanovení NRPC. Možnost ovlivnění afinity receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR) pro ligand 125I-EGF prostřednictvím tyrozin kinázového (TK) inhibitoru gefitinibu byla prozkoumána a popsána v odborné publikaci v kapitole III. Výsledkem práce je zjištění indukujícího vlivu gefitinibu na tvorbu EGFR dimerů. Tvorba receptorového dimeru ovlivňuje charakteristiku interakce EGFR s jeho přirozeným ligandem epidermálním růstovým faktorem (EGF). Prevalence receptorových monomerů, homodimerů a heterodimerů je odlišná mezi buněčnými liniemi a závisí především na míře exprese EGFR a HER2 receptoru na povrchu buněk. EGF se váže na monomerní a dimerní formy EGFR s rozdílnými vazebnými vlastnostmi. Výsledek studie poukazuje na kladný vliv gefitinibu na tvorbu EGFR dimerů, které pak mají vyšší afinitu k 125I-EGF. Publikovaná studie uvedená v kapitole IV se zaměřila na prokázání hypotézy, že afinita receptoru a kinetika reakce mezi ligandem a jeho receptorem se liší napříč buněčnými liniemi. Například přirozený ligand EGF se tak váže s rozdílnou vazebnou silou na ten samý receptor (EGFR) exprimovaný na rozdílných buněčných liniích. Tato zjištění byla ověřena pro protilátku 131I-cetuximab, která se vázala na EGFR s rozdílnou afinitou pro tři buněčné linie. Faktor rozdílu v afinitě protilátky k ligandu měl napříč buněčnými liniemi hodnotu až 10. Možnou příčinou rozdílu v afinitě receptoru k ligandu je jeho různý stupeň glykosylace, nebo tvorba homodimerů či heterodimerů a v neposlední řadě možná mutace receptoru. Uvedené možnosti ovlivnění afinity receptoru pak vedou k případům, kdy velmi dobrý vazebný partner receptoru testovaný in vitro vykazuje velmi nízkou afinitu vazby na cílový receptor v biologickém testování. Podobného zjištění se dosahuje i v aplikaci terapeutických a diagnostických činidel v populaci pacientů, kdy část pacientů neodpovídá na léčbu. Výsledky prací charakterizující úspěšnost in vitro aplikací zkoumaného receptorového ligandu by neměly být generalizovány pro všechny buňky nesoucí zkoumaný receptor, ale měl by být brán zřetel na možné diference mezi buněčnými liniemi. Podobně by měla být vedena i léčba pacientů, která by měla mít individuální přístup. Poslední publikovaná studie zařazená do kapitoly VI si kladla za cíl ověřit, jaký je vliv zvoleného radioizotopu a způsobu radioaktivního značení na chování radioligandu v in vivo a iv vitro podmínkách. Výsledek práce uvádí, že zvolené izotopy 131I a 177Lu a stejně tak metody jejich vazby na transportní protilátku nimotuzumab cílenou proti EGFR nevedly k ovlivnění internalizační charakteristiky radioligandu u buněčných kultur. Opak prokázaly výsledky experimentů provedených in vivo, které poukázaly na některé odlišnosti v distribučních profilech v závislosti na použitých metodách radioaktivního značení. 131I- nimotuzumab vykazoval nejnižší míru vychytávání v játrech a nejdelší čas krevní eliminace ze všech zkoumaných radioligandů. Protilátka nimotuzumab s izotopem 177Lu navázaným prostřednictvím chelatačních činidel (DOTA, DTPA) byla charakterizována poklesem eliminačního času a mnohonásobně zvýšenou retencí v játrech. Uvedené in vivo výsledky potvrdily vliv typu použitého izotopu a způsobu jeho vazby na biologické vlastnosti značené protilátky nimotuzumab v případě testových faktorů, jako byla krevní clearance, vychytávání játry a následná kumulace v játrech.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate Mgr. Pavel Bárta Supervisor Prof. PharmDr. Ing Milan Lázníček, CSc. Title of Doctoral Thesis The study of receptor-specific radiopharmaceuticals interactions with biological systems at the cellular level The targeting of receptor specific peptides or antibodies is one important diagnostic and therapeutic tool in the fight against cancer diseases. Receptor specific peptides often have their origin from the human natural peptide hormones; hence they are commonly marked as peptide analogues. The peptide analogues contain in their amino acids sequence the binding site identical with the site of natural peptides, which they are originated from. This binding site is responsible for the interaction with the targeted receptor. The peptide analogues are employed instead of the natural peptides because their biological properties can be improved, for example facilitating distribution in the organism to their place of action, or protection from biological degradation. The peptide ligand binding itself on targeted receptors and its internalization into cells typically does not trigger a therapeutic effect. From this reason, peptide analogues carry active substances like cytotoxine or radioisotope; this has the therapeutic or diagnostic effect. The therapeutic effect of radioisotope includes cancer cell DNA damage that leads to the loss of ability to proliferate, which in turn causes cell death. The diagnostic purpose of radioisotopes is more common. The gamma radiation is used in imaging techniques to localize tumours. Therapeutic monoclonal antibodies are able to prevent receptor specific signal transmission coming from the interaction of natural ligand with the targeted receptor. The mechanism of this protection typically comes from the blocking of the receptor binding sites. Commonly, the monoclonal antibody effect lies in the blockage of signal transmission from a receptor to effectors proteins situated inside a cell. In fact, monoclonal antibodies themselves often have a low therapeutic effect; hence it is beneficial to use them as transport ligands for cytotoxic substances and radionuclide, which are responsible for the cell death. The radiolabelling of monoclonal antibodies has the diagnostic effect too. The disadvantage of antibody is the size of its molecule. Whereas peptides of short peptide chain are easily distributed to the place of action, antibodies are distributed slowly and undergo faster biodegradation in the liver. The solution of this problem has its origin in the development of antibody fragments in the last years. The antibody fragments are gradually assembled on the targeted receptor protein structure. This method is termed the pre-targeting. The pre-targeting allows easy distribution in the body and decrease the risk of cytotoxic or radiological burden for patients. The aim of the publication in chapter I was to study the potential influence of radiolabelling on the biological properties of minigastrin11 (MG11). This was performed with testing of its ability to interact with cholecystokinin receptor type 2 (CCK2r) and to internalize into pancreatic cancer cells AR42J. Minigastrin analogue was labelled with either 177Lu or 111In. The first mentioned isotope is used in therapeutic oncology and the second one for diagnostic purposes. The complex 111In-DOTA-MG11 binding on the receptor was slow and did not reach ligand – receptor association and dissociation equilibrium even after three hours of incubation. However, the complex 177Lu-DOTA-MG11 interaction on CCK2r reached the equilibrium after one hour incubation and the higher proportion of complex from the whole quantity added to cells was internalized than in the case of 111In-DOTA-MG11. The radiolabelled ligand 177Lu-DOTA-MG11 is able to effectively bind to the targeted CCK2r and has strong assumption to assert itself in Peptide receptor radionuclide therapy (PRRT). The radioligands 177Lu-DOTA-MG11 and 111In-DOTA-MG11 were investigated for their possible radionefrotoxicity, which often accompanies PRRT. The complication of damaged kidneys by radiolabelled peptides is caused with the rear tubular reabsorption, which cumulates radioactive isotopes in the proximal tubular cells. The cell line isolated from opossum kidney proximal tubular cells (OK cells) was employed to test the possible accumulation of 111In- and 177Lu- labelled ligands. The results of the testing were satisfying, because they demonstrated no important accumulation of radioligands into kidney cells. The internalization of radiolabelled peptides reached the maximal values about 0.1 % of the total added amount. Improving the method for the number of receptor per cell (NRPC) quantification was the target in the publication given in chapter II. The study compared the possibilities of NRPC calculation offered by the classical manual method with the possibility of NRPC quantification based on the employment of the automatic instrument LigandTracer®. This instrument allows real-time measurement of the interaction of radiolabelled ligand with targeted receptor on cell surface. The new kind of NRPC quantification was denoted as KEX method. The name comes from the basic principle of the method, which lies in kinetic extrapolation of the ligand – receptor interaction, which means the calculation of the theoretical value Bmax. The theoretical Bmax corresponds to the signal of completely saturated receptors on cell surface. The manual method belongs to the techniques of receptor quantification verified with many years of use and thus it is the golden standard of NRPC techniques. The measured values with the classical manual method and KEX technique demonstrated the compliance. The KEX technique sometimes showed slight overestimation of the calculated receptor number against the classical method. However, the KEX technique can be included among methods allowing cell receptor quantification and can be used in biological sciences or in nuclear medicine in the future. The rapid quantification of receptors and the ability binding of radiolabelled ligand to targeted cell surface protein structures can make the progress in the research of new potential therapeutic or diagnostic molecules for cancer treatment. The importance and validity of the KEX technique was repeatedly verified in another experimental study, which is summarized in the chapter V. The values of quantified number of receptors measured by the assays like the KEX technique, the classical manual method and western blotting on employed cell lines were compared in this study. The obtained results confirmed the accuracy of the KEX technique, so it can be counted in methods for NRPC quantification. The scientific publication introduced in the chapter III was focused on the study of epidermal growth factor receptor (EGFR) affinity, which can be influenced in the present of gefitinib, the tyrosine kinase (TH) inhibitor. The finding of this study was that gefitinib could influence the formation of EGFR dimers. The formation of EGFR dimers can alter the interaction between EGFRr and its natural ligand epidermal growth factor (EGF). The prevalence of receptor monomers, homodimers and heterodimers differs among cell lines and depends on EGFR and HER2 receptor expression rate on a cell surface. EGF binds with different binding properties on monomer or dimer forms of EGFR. The conclusion of the study refers to the positive influence of gefitinib on EGFR dimers formation, which increases the receptor affinity to 125I-EGF. The publication in the chapter IV attempted to prove the hypothesis that the receptor affinity and the kinetic reaction between ligand and its receptor differed across the cell lines. For example, the natural ligand EGF binds with different binding strength on the same receptor (EGFR) expressed in various cell lines. This finding was proved with the employment of the monoclonal antibody 131I-cetuximab attached to EGFR with different binding affinity on three used cell lines. The affinity difference factor among cell lines was about 10. The reason of the different receptor affinity to the ligand may lie in the various level of the receptor glycosylation, formation of homodimers or heterodimers and possible receptor mutation. The above mentioned options influencing the receptor affinity lead to the cases, when very good receptor binding ligand tested in vitro have very low affinity in vivo. The same findings can be in the use of therapeutic or diagnostic substances in a patient population. Some patients do not respond to a treatment. The results of successfully in vitro tested receptor ligands should not be generalized for every cell line carrying the same receptor. It should be taken into account the differentiation among cell lines. The same should be reconsidered for patient treatment, which ought to have an individual approach. The last publication included in this thesis is in the chapter VI. It was aimed at the characterisation of radioligand properties in in vitro and in vivo conditions after its radiolabelling. The two factors influencing the radioligand character were studied like the choice of isotope and the manner of radiolabelling. The findings made for in vitro studies concluded that the chosen isotopes 131I and 177Lu and the methods of their labelling on the transportation monoclonal antibody nimotuzumab did not alter antibody internalization characteristics into employed cell lines. However, the opposite was found for in vivo experiments which demonstrated the differences in distribution profiles depending on the methods for radiolabelling. 131I- nimotuzumab showed the lowest rate of accumulation in the liver and the longest time of blood elimination of all examined radiolabelled ligands. The antibody labelled with 177Lu via chelating compounds (DOTA, DTPA) was characterized with decreased elimination time and much more increased retention in the liver. The introduced in vivo results confirmed the influence of employed isotope and manner of its labelling on the radiolabelled antibody biological properties in the case of tested factors like blood clearance, the liver biodegradation and accumulation.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Pavel Bárta, Ph.D. 28.96 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Pavel Bárta, Ph.D. 65 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Pavel Bárta, Ph.D. 62 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Prof.PharmDr.Ing. Milan Lázníček, CSc. 130 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. PharmDr. Petr Nachtigal, Ph.D. 110 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Rudolf Štětina, CSc. 136 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Prof.MUDr. Radomír Hrdina, CSc. 129 kB