velikost textu

Analytické hodnotenie liečiv a potenciálnych liečiv zo skupiny látok chelatujúcich železo

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Analytické hodnotenie liečiv a potenciálnych liečiv zo skupiny látok chelatujúcich železo
Název v češtině:
Analytické hodnocení léčiv a potenciálních léčiv ze skupiny látek chelatujících železo
Název v angličtině:
Analytical Evaluation of Drugs and Drug Candidates from the Group of Iron Chelating Agents
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Ján Stariat, Ph.D.
Školitel:
Prof.RNDr. Jiří Klimeš, CSc.
Oponenti:
Doc. RNDr. Dalibor Šatínský, Ph.D.
Ing. Luděk Šišpera, CSc.
Konzultant:
Doc. PharmDr. Petra Kovaříková, Ph.D.
Id práce:
104201
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy (16-16190)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmaceutická analýza (DFA)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
18. 5. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Informace o neveřejnosti:
Příloha práce byla vyloučena ze zveřejnění.
Jazyk práce:
Slovenština
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Kandidát Mgr. Ján Stariat Školiteľ Prof. RNDr. Jiří Klimeš, CSc. Názov dizertačnej práce Analytické hodnotenie liečiv a potenciálnych liečiv zo skupiny látok chelatujúcich železo Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) má v analýze liečiv dominantné postavenie, pretože patrí medzi robustné techniky, umožňujúce dosiahnutie účinnej separácie väčšiny analytov prítomných vo vzorku, a zároveň ich kvalitatívne aj kvantitatívne hodnotenie. Pokroky vo vývoji stacionárnych fáz a detekčných techník umožňujú výrazne skrátiť čas analýzy, a zároveň získať celé spektrum informácií o povahe analytov prítomných vo vzorkách aj vo veľmi nízkych koncentráciách. Nádorové ochorenia sa stále radia medzi významné príčiny smrti, z čoho vyplýva požiadavka na vývoj nových liečebných postupov. Stratégia založená na chelatácii železa vnútri nádorových buniek by mohla výraznou mierou prispieť k zlepšeniu prognózy u pacientov s tumormi rezistentnými voči štandardnej chemoterapii. Tento mechanizmus antiproliferativného pôsobenia je aktívne rozvíjaný u novej skupiny potenciálnych liečiv štruktúrne odvodených od thiosemikarbazonu, u ktorých bol cytostatický účinok pozorovaný in vitro aj in vivo Ďalší pokrok v tejto oblasti je výraznou mierou závislý na dostupnosti vhodných bioanalytických metód pre hodnotenie týchto potenciálnych liečiv v biologickom materiáli. Princíp chelatácie železa je taktiež spomínaný aj v prípade mechanizmu účinku dexrazoxanu – jediného klinicky dostupného kardioprotektíva schopného chrániť myokard pred toxickými účinkami antracyklinov. Tento princíp však doposiaľ nebol jednoznačne potvrdený, čo je do istej miery spôsobené nedostupnosťou bioanalytickej metódy schopnej hodnotenia tohto liečiva a jeho aktívnych metabolitov v mieste jeho pôsobenia – v srdečnom tkanive. Prvý tematický celok tejto dizertačnej práce bol zameraný na analytické hodnotenie chelátorov železa odvodených od thiosemikarbazonu. V úvodnej fáze boli vyvinuté a validované HPLC-UV metódy pre hodnotenie in vitro stability u 2-hydroxy-1-naftylaldehyd- 4-methyl-3-thiosemikarbazonu (N4mT) a di(2-pyridyl)keton-4,4-dimethyl-3- thiosemikarbazonu (Dp44mT) v plazme, ktorá bola zároveň porovnaná so stabilitou pyridoxal-isonikotinoylhydrazonu (PIH) – materskej látky aroylhydrazonových chelátorov. Výsledky tejto práce poukázali na vyššiu stabilitu nových thiosemikarbazonov v porovnaní s ich aroylhydrazonovými predchodcami. Následne bola vyvinutá a validovaná HPLC-MS/MS metóda schopná kvantifikácie E/Z izomérov 2-benzoylpyridin-4-ethyl-3-thiosemikarbazonu (Bp4eT). Metóda bola využitá v štúdiu rozpustnosti Bp4eT vo vodných rozpúšťadlách a farmaceutických kosolventoch, a súčasne bolo navrhnuté zloženie formulácie vhodné pre i.v. podanie tejto látky. Vzápätí bol študovaný in vitro a in vivo metabolizmus 1. fáze u Bp4eT. Štruktúry dvoch metabolitov detegovaných v in vitro vzorkách boli navrhnuté na základe výsledkov HPLC- MS/MS experimentov, a následne potvrdené pomocou NMR a IČ spektrometrie. Oba oxidačné metabolity boli taktiež detegované in vivo, a zároveň tu bol identifikovaný nový hydroxylovaný metabolický produkt. Posledná práca prvého celku bola venovaná novo pripravenému thiosemikarbazonovému analógu - di(2-pyridyl)keton-4-methyl-4-cyklohexyl-3-thiosemikarbazonu (DpC), u ktorého bol detailne skúmaný in vitro metabolizmus 1. a 2. fáze pomocou UPLC-QTOF metódy. Štruktúry metabolitov boli spočiatku navrhnuté na základe dát získaných analýzou s vysokým rozlíšením a presným určením hmoty a vzápätí potvrdené pomocou štúdia ich fragmentácie. Spolu bolo detegovaných 10 metabolitov 1. fáze medzi ktoré patrili produkty oxidácie thiokarbonylovej skupiny, N-demethylácie, hydroxylácie, otvorenia cyklohexylu spojeného s adíciou vody, a zároveň rôzne kombinácie týchto reakcií. V prípade konjugačných metabolitov boli detegované dva glukuronidy, zatiaľ čo sulfáty a konjugáty s glutathionom neboli objavené. Náplňou druhého celku bolo štúdium možnosti separácie a popisu mechanizmu retencie u dexrazoxanu a jeho metabolitov v HILIC móde za podmienok kompatibilných s hmotnostnou detekciou. Separácia všetkých analytov bola dosiahnutá iba na kolóne so stacionárnou fázou na báze zwiterionov. Výsledky tejto práce taktiež potvrdzujú prítomnosť komplexného mechanizmu retencie v HILIC móde, v ktorom sa môže uplatniť adsorpcia, rozdeľovanie a iónová interakcia.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control Candidate Mgr. Ján Stariat Supervisor Prof. RNDr. Jiří Klimeš, CSc. Title of Doctoral Thesis Analytical evaluation of drugs and drug candidates from the group of iron chelating agents High performance liquid chromatography (HPLC) ranks among the most important analytical techniques in the field of pharmaceutical analysis thanks to its robustness and the ability to separate and qualitatively and quantitatively analyse the compounds presented in various samples. The ongoing progress in the development of novel stationary phases and detection techniques allows rapid analysis and to get comprehensive characterization of the analytes presented in the complex samples even at very low concentrations. Cancer still remains a leading cause of death, thus the need for novel, efficient treatment strategies is of crucial importance. The mechanism based on iron chelation (Fe) inside the tumour cells represents one of the most promising strategy which could enhance the prognosis of patients suffering from cancer resistant to standard chemotherapy. Thiosemicarbazone iron chelators are currently under intensive development as novel anticancer drugs. Their strong antiproliferative activity has been already described both in vitro and in vivo. However, the further progress of their development strongly requires proper analytical techniques for their analysis in biological materials. The mechanism of action of the only clinically used cardioprotectant efficient against antracycline toxicity - dexrazoxane is also supposed to be mediated by iron chelation. However, this assumption has never been unambiguously confirmed. This could be partially caused by the lack of bioanalytical methods capable to simultaneously evaluate the drug and its active metabolites in the target organ – in a myocardium. The first part of this doctoral thesis was focused on analytical evaluation of the thiosemicarbazone iron chelators. At the beginning, novel HPLC-UV methods were developed and validated for the determination of in vitro stability of 2-hydroxy-1- naphthylaldehyde-4-methyl-3-thiosemicarbazone – (N4mT) and di(2-pyridyl)ketone-4,4- dimethyl-3-thiosemicarbazone (Dp44mT) in plasma. Their stability was subsequently compared with stability of the parent compound of the aroylhydrazone chelators - pyridoxal isonicotinoyl hydrazone (PIH). The results of these experiments pointed on apparently higher stability of thiosemicarbazones in comparison to their aroylhydrazone forerunners. Novel HPLC-MS/MS method capable to quantify E/Z izomers of 2-benzoylpyridine-4-ethyl-3- thiosemikarbazone (Bp4eT) was developed and validated. The method was successfully applied to solubility study of Bp4eT in various aqueous media as well as pharmaceutical cosolvents. Furthermore, it was utilized to propose the composition of a pharmaceutical formulation suitable for i.v. application of this drug. The phase I metabolism of Bp4eT was studied in vitro and in vivo. Two metabolites were detected in vitro and their chemical structures were proposed based on HPLC-MS/MS experiments. These suggestions were subsequently confirmed by the analysis of their standards characterized by NMR and IR spectrometry. Both oxidative metabolites were also detected in vivo together with the newly found hydroxylated metabolic product. The last work of the first part was focused on identification of in vitro phase I/II metabolites of newly developed thiosemicarbazone analog - di(2-pyridyl)ketone-4-methyl-4-cyclohexyl-3- thiosemicarbazone (DpC) using UPLC-QTOF. Initially, the chemical structures of the metabolites were proposed based on the high resolution analysis with accurate mass measurement. These were subsequently confirmed by the fragmentation study. Ten phase I metabolites were detected, among which the products of the thiocarbonyl group oxidation, N- demethylation, hydroxylation, cyclohexyl ring opening coupled with water addition as well as the various combinations of these reactions were identified. In the case of phase II conjugates, only two glucuronides were detected, while the sulphates and glutathione conjugates were not found. The second part of the thesis was intended to investigate the feasibility of the HILIC mode for the simultaneous analysis of dexrazoxane and its polar metabolites (B, C, ADR-925). The particular attention was also pay on description of the retention mechanism under MS compatible chromatographic conditions. The separation of all compounds in one analytical run was achieved only on the zwitterion-based stationary phase. This systematic study of the retention behavior confirmed the participation of mixed mode retention mechanism, among which the partitioning, adsorption and ion-exchange could be involved.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Ján Stariat, Ph.D. 1.15 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Ján Stariat, Ph.D. 3.7 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Ján Stariat, Ph.D. 77 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Ján Stariat, Ph.D. 75 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Prof.RNDr. Jiří Klimeš, CSc. 171 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. RNDr. Dalibor Šatínský, Ph.D. 186 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Luděk Šišpera, CSc. 144 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Doc. RNDr. Jaroslav Sochor, CSc. 121 kB
Stáhnout Errata Mgr. Ján Stariat, Ph.D. 120 kB