velikost textu

Kvantitativní analýza léčiv v biologických materiálech separačními metodami

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Kvantitativní analýza léčiv v biologických materiálech separačními metodami
Název v angličtině:
Quantitative Measurement of Drugs in Biological Samples using Chromatography Methods.
Typ:
Disertační práce
Autor:
PharmDr. Jana Maláková, Ph.D.
Školitel:
Doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc.
Oponenti:
Doc. RNDr. Miroslav Polášek, CSc.
doc. Ing. Jaroslav Chládek, Ph.D.
Id práce:
104183
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy (16-16190)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmaceutická analýza (DFA)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
8. 3. 2012
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Kandidát: PharmDr. Jana Maláková Školitel: Doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc. Název dizertační práce: Kvantitativní analýza léčiv v biologických materiálech separačními metodami Disertační práce uvádí instrumentální analytické metody určené k analýze léčiv a jejich metabolitů v biologických vzorcích za využití kapalinové a plynové chromatografie. Ve fázi optimalizace analytických podmínek byly testovány různé postupy přípravy vzorků. Od běžné precipitace bílkovin acetonitrilem (tento přístup byl aplikován např. při kvantitativní analýze cefuroximu), přes extrakci kapalina-kapalina (osvědčil se u metody analýzy topiramátu, 8-methoxypsoralenu) a konečně extrakty vhodné k separaci byly získány i extrakcí na pevné fázi s využitím sorbentů ve směsném módu (na principu reverzní fáze v kombinaci s iontovou výměnou) při analýze galantaminu a jeho metabolitů. Ultrafiltrace vzorků plazmy na na filtrech Microcon YM 10 umožnila oddělení volného a vázaného podílu léčiva a určení vazebnosti (u metody na stanovení cefuroximu). Vlastní chromatografické podmínky tj. volba plynové nebo kapalinové chromatografie, závisela na fyzikálně chemických vlastostech stanovovaného léčiva. A pokud tyto vlastnosti nebyly pro daný systém vhodné, bylo možno derivatizací, např. methylací v případě topiramátu, molekulu léčiva modifikovat k zajištění tepelné stability během GC. V případě metod využívajících kapalinovou chromatografii byly optimální separační podmínky studovány na širokém spektru kolon nejčastěji na bázi silikagelu s navázanými různými funkčními skupinami, které určovaly jejich selektivitu a polaritu. Pro analýzu cefuroximu se tak osvědčila kolona Ascentis (Supelco) s amidovými skupinami vhodná pro analýzu polárních látek. Separace galantaminu a jeho metabolitů epigalantaminu, O-des- methylgalantaminu a N-desmethylgalantaminu byla z hlediska rozlišení a tvaru píků nejlepší na koloně Discovery HS F5 obsahující pentafluorofenylpropylovou skupinu navázanou na silikagel. Zvláštˇpozoruhodné bylo na uvedené separaci rozlišení galantaminu a jeho stereoizomeru epigalantaminu za podmínek reverzní fáze. Samostatnou kapitolou bylo pak testování chirální separace (R)-warfarinu a (S)-warfarinu. Polárně-organický mód a chirální kolony na bázi cyklodextrinu byly nahrazeny principem reverzní fáze a kolonou s vysoce čistým sférickým silikagelem s navázáným amfoterním glykopeptidem vankomycinem. Detekce analytů při HPLC zahrnovala použití UV detektoru s diodovým polem a tam, kde k tomu byly předpoklady z hlediska struktury dané přítomností fluoroforní skupiny, se uplatnil citlivější a selektivnější fluorescenční detektor (např. při analýze galantaminu a metabolitů nebo u enantiomerů warfarinu). Galantamin a jeho metabolity byly v extraktech z jaterní tkáně potkanů identifikovány pomocí ESI hmotnostních spekter na hmotnostním detektoru typu iontové pasti. Převedení metody z HPLC na kapilární plynovou chromatografii s hmotnostní detekcí znamenalo v případě kvantitativní analýzy 8-methoxypsoralenu (8-MOP) podstatné zlepšení analytických parametrů především citlivosti a selektivity. Kapilární kolona na bázi 95 % dimethyl- a 5 % difenyl polysilarenu byla použita k separaci 8-MOP nebo methylovaného topiramátu na GC/MS analyzátoru. Změna detekce z alkalického dusíkového ionizačního detektoru na hmotnostní detektor typu kvadrupólu při kvantitativní analýze antiepileptika topiramátu o řád zvýšila citlivost metody GC. Po fázi optimalizace analytických podmínek byly experimentálně ověřeny validační parametry kvantitativních metod. Metody splňovaly požadované limity na citlivost, parametry preciznosti, přesnosti a selektivity a byly proto aplikovány při měření vzorků získaných z experimentálních studií nebo zavedeny do rutinní praxe při analýze vzorků v rámci terapeutického monitorování u pacientů. HPLC metoda s fluorescenční detekcí pro stanovení galantaminu byla například použita ve studii, zabývající se absorpcí cholinesterázového inhibitoru galantaminu a jejím ovlivnění L-karnitinem na modelu perfúze střeva in situ u potkana. HPLC metoda s UV detekcí využívající diodové pole umožnila měření koncentrací volného a vázaného podílu v plazmě u profylakticky podávaného antibiotika cefuroximu a koncentrací cefuroximu v dialyzátech z intersticiální mikrodialýzy svalu v průběhu operace srdce. Farmakokinetika cefuroximu včetně plazmatické vazebnosti byla ovlivněna fyziologickými změnami při kardiopulmonálním bypassu. Koncentrace cefuroximu v plazmě a dialyzátech (resp. ve svalu) byly vyšší než minimální inhibiční koncentrace potenciálních patogenů. Lze usuzovat, že testované dávkové schema cefuroximu poskytovalo účinné antibakteriální hladiny v periferní tkáni při operačním zákroku na srdci při kardiopulmonálním bypasu. Chirální separace (R)-warfarinu a (S)-warfarinu na stacionární fázi s navázaným glykopeptidem vankomycinem a fluorescenční detekce se uplatnily při potvrzení stejnoměrné akumulace obou izomerů v buňkách hepatomu linie HepG2. Metodou kapilární plynové chromatografie s hmotnostní detekcí bylo stanoveno antiepileptikum topiramát ve vzorcích od pacientů s epilepsií a léčivo 8-methoxypsoralen při hledání optimální dávky při imunomodulační technice fotoferezy u pacientů po transplantaci kostní dřeně.
Abstract v angličtině:
Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradci Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control Candidate: PharmDr. Jana Maláková Supervisor: Doc. PharmDr. Milan Nobilis, PhD., Associate Professor of Bioorganic Chemistry. Title of Doctoral Thesis: Quantitative measurement of drugs in biological samples using chromatography methods. The thesis deals with the application of instrumental analytical methods to the quantitative measurement of drugs and their metabolites in biological samples using liquid and gas chromatography. Various procedures of sample preparation were evaluated during optimization of analytical assays. Precipitation of proteins with acetonitrile was employed (analysis of cefuroxime), liquid-liquid extraction (analysis of topiramate, 8-methoxypsoralen) and samples were also purified using a mixed-mode solid-phase extraction (reversed-phase and ion-exchange principle) during the analysis of galantamine and its metabolites. The unbound cephuroxime fraction in the plasma and protein binding were determined using an ultrafiltration method. Chromatography conditions – gas or liquid chromatography- depended on physico-chemical characteristics of a drug. Due to the thermal decomposition of topiramate, derivatization was used to form a more stable methyl derivative for GC. During method development in case of liquid chromatogramy, optimum separation was studied using a wide spectrum of columns, most often based on silica gel bonded structural functions with unique selectivity and polarity. Ascentis (Supelco) column with amide groups was suitable for the analysis of polar cephuroxime. In terms of resolution and peak symmetry, Discovery HS F5 column with pentafluorophenylpropyl bonded to silica gel was selected for the separation of galantamine and its metabolites epigalantamine, O-desmethyl-galantamine and N-desmethyl-galantamine. Separation of galantamine and its stereoisomer epigalantamine under reverse-phase conditions was especially remarkable. Special section deals with the chiral separation of (R)-warfarin and (S)-warfarin. Polar organic mode and chiral cyclodextrin-based column were replaced by reverse-phase column containing pure spheric silica gel with amphotheric glycopeptide vancomycin. HPLC detection of analytes involved UV photodiode-array detector. For fluorophore- containing structures a more sensitive and selective fluorescence detector was used (eg. analysis of galantamine and metabolites or warfarin enantiomers). Galantamine and its metabolites were identified in the liver extracts using ESI mass spectra obtained with the ion trap analyzer. The HPLC method with fluorescence detection for determination of 8-methoxypsoralen (8-MOP) was abandoned and the capillary GC/MS method was used to improve sensitivity and selectivity. A capillary column based on the Crossbond® silarene phase was employed for the separation of 8-MOP or methyl topiramate on the GC/MS analyzer. Switching from nitrogen phosphorus detector to quadrupole mass analyzer increased sensitivity of the GC method for the determination of antiepileptic topiramate by one order of magnitude. Following the optimization of the analytical methods, the validation characteristics were evaluated. The methods met the required limits of sensitivity, precision and accuracy, and were therefore applied to the analysis of samples from experimental studies or used for therapeutic drug monitoring. For example, the HPLC method with fluorescence detection was employed for the quantitative determination of galantamine in the study focused on the intestinal absorption of galantamine and its modulation by transmembrane enhancer L-carnitine in rat using an in situ perfusion method. The HPLC method using the UV photodiode-array detector allowed the determination of the bound and unbound cephuroxime fraction in the plasma and the concentration of cephuroxime in the dialysates from interstitial microdialysis of the skeletal muscle during a cardiac surgery. Pharmacokinetics of cephuroxime including plasma binding was influenced by physiological changes during cardiopulmonary bypass. Cephuroxime concentrations in the plasma and in the dialysates (in the skeletal muscle) were higher than the minimum inhibitory concentrations of potential pathogens. The dosage of cephuroxime tested in such way provided effective antibacterial concentrations in the peripheral tissue during a cardiac surgery using cardiopulmonary bypass. Chiral separation of (R)- and (S)-warfarin on a vancomycin-based column with the fluorescence detection confirmed the same accumulation of both isomers in hepatoma HepG2 cell line. The GC/MS methods were used for the determination of topiramate in epileptic patients and for optimization of 8-MOP dosage in patients with a bone marrow transplantation undergoing photopheresis.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce PharmDr. Jana Maláková, Ph.D. 49.96 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce PharmDr. Jana Maláková, Ph.D. 89 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky PharmDr. Jana Maláková, Ph.D. 12 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc. PharmDr. Milan Nobilis, CSc. 131 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. RNDr. Miroslav Polášek, CSc. 150 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Ing. Jaroslav Chládek, Ph.D. 142 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Prof.RNDr. Jiří Klimeš, CSc. 121 kB