velikost textu

Transkriptomika embryonální genomové aktivace preimplantačního vývoje skotu v podmínkách in vivo a in vitro kultivace

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Transkriptomika embryonální genomové aktivace preimplantačního vývoje skotu v podmínkách in vivo a in vitro kultivace
Název v angličtině:
Transcriptomics of bovine preimplantation embryo genome activation in vivo and in in vitro culture conditions
Typ:
Disertační práce
Autor:
Ing. Kateřina Vodičková, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Jiří Kaňka, DrSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Ing. Jaroslav Petr, DrSc.
RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D.
Id práce:
104058
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová biologie (P1520)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
4. 5. 2011
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
SSH, real-time PCR, cDNA mikročipy, embryonální aktivace genomu
Klíčová slova v angličtině:
SSH, real-time PCR, cDNA microarray, embryonic genome activation
Abstrakt:
ABSTRAKT Cílem práce bylo charakterizovat transkripční profil in vivo a in vitro získaných embryí během bovinní minoritní a majoritní genomové aktivace a dále identifikovat mRNA transkripty, které jsou nově syntetizované během těchto stádií. V naší první studii jsme se zaměřili na studium minoritní aktivace genů ve 4-buněčném stádiu embrya. Pomocí metody supresivní subtraktivní hybridizace (SSH) jsme nalezli 31 amplikonů homologních s již známými geny. Pro podrobnější studium exprese během celého období preimplantačního vývoje jsme vybrali 5 genů: centromere protein, 350/400 kDa (CENPF, mitosin), splicing factor arginine/serine-rich 3 (SRFS3), high mobility group nucleosomal binding domain 2 (HMGN2) protein a eukaryotické translační iniciační faktory EIF4A2 a EIF4E. Všechny tyto geny hrají důležitou roli v raném vývoji embrya. Gen SRFS3 je prvním genem s významnou funkcí, jehož exprese byla nalezena již v průběhu minoritní genomové aktivace, což potvrdila citlivost jeho transkripce k α-amanitinu v tomto stádiu. Pro další studium jsme si vybrali gen CENPF (centromeric protein F, mitosin), jehož funkci během preimplantačního vývoje bovinního embrya jsme podrobně studovali pomocí specifického umlčení injikací double- stranded (dsRNA) do embrya ve stádiu zygoty. Zjistili jsme, že mikroinjekce CENPF dsRNA efektivně a specificky způsobuje degradaci mRNA CENPF. Při imunofluorescenčním značení pomocí anti-CENPF protilátky byla u CENPF dsRNA injikovaných embryí úroveň fluorescence velmi nízká oproti kontrolám a blastomery CENPF dsRNA injikovaných embryí měly často fragmentovaná nebo úplně chybějící jádra. Vývojová kompetence zaznamenala významný pokles, pouze 28,1% CENPF dsRNA injikovaných 8-buněčných embryí bylo schopno pokračovat ve vývoji do stádia 16 buněk. Tyto výsledky ukazují, že deplece CENPF mRNA vede k dramatickému poklesu vývojové kompetence bovinních embryí po embryonální genomové aktivaci. Při stanovení transkripčního profilu minoritní a majoritní genomové aktivace (ve stádiu 4 a 8 buněk) v in vivo získaných a in vitro kultivovaných embryích skotu jsme použily specifický preimplantační bovinní mikročip (BlueChip). Nejprve jsme pomocí sérií SSH připravili cDNA knihovny (4-buněčné stadium – MII oocyty, 4-buněčné stádiu – 8-buněčné stadium a 8-buněčné stadium – 4-buněčné stadium) a vybrané cDNA z těchto knihoven byly použity v návrhu verze 3 mikročipu BlueChip. Mezi 4- buněčnými in vivo a in vitro embryi bylo rozdílně exprimováno 134 genů a mezi 8-buněčnými embryi 97 genů. Pomocí metody qRT-PCR byl stanoven expresní profil během celého preimplantačního vývoje u 7 vybraných genů (BUB3, CUL1, FBL, NOLC1, PCAF, GABPA a CNOT4). Analýza odhalila významné rozdíly v hladině transkriptů mezi in vitro a in vivo získanými embryi v pozdních 8-buněčných stádiích u genů BUB3, NOLC1, PCAF, GABPA a CNOT4. Identifikovali jsme přepnutí genové exprese dvou příbuzných genů cullin 1-like, transkripční varianty 1 (UniGene ID BT.36789) na cullin 1, transkripční variantu 3 (UniGene ID BT.6490) během majoritní genomové aktivace ve stádiu 8 buněk. Pomocí imunofluorescence jsme nalezli nově syntetizovaný protein fibrillarin již ve stádiu raných 8 buněk po in vitro kultivaci. Tato detekce je potvrzena pomocí metody qRT-PCR na úrovni mRNA. Nalezené geny mohou sloužit jako ukazatel kvality embryí ve snaze optimalizovat podmínky kultivace in vitro.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT The goal of the thesis was to characterize transcriptional profiles of in vivo and in vitro derived embryos during bovine minor and major embryonic genome activation and to identify mRNA transcripts newly synthesized during these stages. In our first work we have concentrated on the study of minor genome activation at the 4-cell stage of embryo. Using SSH, we have identified 31 amplicons homologous with already identified genes. We have selected 5 of these for detailed study of their expression during the whole period of preimplantation development: centromere protein, 350/400 kDa (CENPF, mitosin), splicing factor arginine/serine-rich 3 (SRFS3), high mobility group nucleosomal binding domain 2 (HMGN2) protein and eukaryotic translation initiation factors EIF4A2 a EIF4E. All these genes play an important role in the early embryo development. SRFS3 is the first described gene with an important function in preimplantation development, which is expressed already during bovine minor genome activation, and its transcription is α-amanitin sensitive during this period. We have selected CENPF gene for a more thorough study. By silencing its expression by the injection of CENPF dsRNA into the zygote, we have studied its function throughout the whole preimplantation development of bovine embryo. Microinjection of CENPF dsRNAS resulted in specific and effective degradation of CENPF mRNA. Immunofluorescence staining with anti-CENPF antibody showed very low fluorescence levels in CENPF dsRNA injected embryos comparing to uninjected controls and blastomeres of CENPF dsRNA injected embryos often had fragmented or missing nuclei. There was apparent marked decrease in a developmental competence, only 28.1% of the CENPF dsRNA injected 8-cell stage embryos reached 16-cell stage. It can be concluded, that depletion of CENPF mRNA leads to dramatic decrease of developmental competence of bovine embryos at the stage of major genome activation. We have used bovine preimplantation embryo specific cDNA microarray (BlueChip) to characterize transcriptional profile of the in vivo derived and in vitro prepared bovine embryos at the stage of minor (4-cell stage) and major (8-cell stage) genome activation. First we have prepared SSH cDNA libraries (4-cell stage embryos – MII oocytes, 4-cell stage embryos – 8-cell stage embryos and 8-cell stage embryos – 4-cell stage embryos) and selected cDNAs from these libraries were used in BlueChip version 3 array design. We have identified 134 genes as differentially expressed between bovine 4-cell stage in vivo and in vitro embryos and 97 genes as differentially expressed between 8-cell stage in vivo and in vitro embryos. Using qRT-PCR, we have characterized expression profile of 7 selected genes (BUB3, CUL1, FBL, NOLC1, PCAF, GABPA and CNOT4) throughout preimplantation development. Our analysis revealed significant changes in the level of expression of BUB3, NOLC1, PCAF, GABPA and CNOT4 at the late 8-cell stage. We have also identified switch in the expression of two related genes, from the cullin 1-like, transcript variant 1 (UniGene ID BT.36789) to cullin 1, transcript variant 3 (UniGene ID BT.6490) during the time of major genome activation at 8-cell stage. Using immunofluorescence staining, we have found fibrillarin protein already at the early 8-cell stage in vitro cultured embryos. This finding was also confirmed on mRNA level by qRT-PCR. The complex of these genes could be used as a tool for assessing embryo quality for optimization of IVP embryo culture conditions.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Ing. Kateřina Vodičková, Ph.D. 8.93 MB
Stáhnout Příloha k práci Ing. Kateřina Vodičková, Ph.D. 4.03 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Ing. Kateřina Vodičková, Ph.D. 80 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Ing. Kateřina Vodičková, Ph.D. 79 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Ing. Kateřina Vodičková, Ph.D. 1.31 MB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Ing. Jaroslav Petr, DrSc. 53 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Ing. Vladimír Krylov, Ph.D. 111 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 931 kB