velikost textu

Generation and analysis of mutant mouse models to study pathophysiological roles of KLK5 and KLK7 in epidermis

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Generation and analysis of mutant mouse models to study pathophysiological roles of KLK5 and KLK7 in epidermis
Název v češtině:
Tvorba a analýza mutantních myších modelů pro studium patofyziologické role KLK5 a KLK7 v pokožce
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Bc. Petr Kašpárek
Školitel:
doc. RNDr. Radislav Sedláček, Ph.D.
Oponenti:
doc. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D.
RNDr. Ondřej Machoň, Ph.D.
Id práce:
100362
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
13. 4. 2017
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Peptidázy příbuzné kallikreinu (KLK) představují rodinu vzájemně spřízněných serinových proteáz, které jsou kódovány geny umístěnými v jediném chromozomálním lokusu. Jejich exprese byla popsána v mnoha tkáních a řada experimentů in vitro naznačuje významnou roli KLK v mnoha fyziologických i patologických procesech. Přesto jsou skutečné úlohy KLK v živém organismu stále ne zcela objasněny, což je způsobeno zejména nedostatkem vhodných zvířecích modelů pro jejich studium. Přestože genově-deficientní myší modely pro některé KLK již byly vytvořeny, jejich význam pro objasnění rolí těchto proteáz v komplexním prostředí živého organismu byl jen omezený. Jednou z hlavních překážek je částečný funkční překryv mezi některými KLK. Inaktivace jednoho genu tudíž často nevede ke změně fenotypu v důsledku funkční kompenzace mezi jednotlivými proteázami. Zdá se tedy, že klasické myší modely deficientní pro jeden gen jsou ne zcela vhodným nástrojem pro studium KLK in vivo. V této práci jsme použili TAL efektor nukleázy (TALENy) pro přípravu několika nových mutantních myších linií, které umožňují analýzu komplexních proteolytických sítí tvořených KLK a studium jejich role ve zdravém organismu i během chorobných procesů. Připravili jsme nový model pro Nethertonův syndrom (NS), autosomálně recesivní kožní chorobu způsobenou mutací v genu SPINK5, který kóduje inhibitor KLK - LEKTI. NS je spojený se zvýšenou proteolytickou aktivitou KLK, která vede k chronickému zánětu kůže, postižení vlasů a výraznému narušení kožní bariéry. Náš nový model pro NS je založen na modifikaci myšího genomu tak, aby obsahoval v genu Spink5 mutaci dříve popsanou u pacienta s NS. Prokázali jsme, že myši nesoucí tuto mutaci věrně mimikují symptomy NS a v důsledku selhání kožní bariéry umírají krátce po narození. Abychom popsali roli KLK v patologii NS, připravili jsme mutantní myší linie deficientní pro KLK5, KLK7 a dvojitě-deficientní pro KLK5 a KLK7, které jsme následně křížili s mutanty pro Spink5. Ukázali jsme, že zatímco samotná inaktivace KLK5 ani KLK7 není dostatečná pro potlačení letálního fenotypu myší postrádajících inhibitor LEKTI, současná inaktivace obou proteáz vede k úplnému vymizení kožních defektů, díky čemuž jsou myši schopny dosáhnout dospělosti, kdy nevykazují žádné poruchy kůže ani růstu srsti. Prokázali jsme, že obě proteázy – KLK5 i KLK7 – hrají významnou úlohu při vyvolání zánětu a rozvoji poruch kožní diferenciace, jež jsou specifické pro NS a také že proteolytická aktivita KLK7 není výhradně závislá na aktivaci KLK5. Detailní analýza myší dvojitě deficientních pro KLK5 a KLK7 pak prokázala, že se u těchto mutantů za fyziologických podmínek rozvine silná hyperkeratóza. Jde o první důkaz in vivo, že jsou obě proteázy zapojeny do procesu odlučování kožních buněk z povrchu pokožky. Ukázali jsme také, že technologie TAL-efektor nukleáz může být využita pro přípravu netradičních myších mutantních modelů, ve kterých pouze některé buňky vykazují ablaci cílového genu (tj. genetických mozaik). Díky mozaikové inaktivaci genu Spink5 jsme pak připravili mutantní myši, jež vykazovaly nadměrnou proliferaci keratinocytů, chronický zánět a alopecii, tedy symptomy spojené s NS. Na rozdíl od Spink5-deficientních myších linií, Spink5 - mozaiky neumírají krátce po narození, což umožňuje celou řadu dlouhodobých experimentů, např. testování preparátů určených pro léčbu NS. Souhrnně vzato, pomocí technologie programovatelných nukleáz jsme připravili několik mutantních myších linií deficientních pro KLK proteázy nebo jejich inhibitor LEKTI. Zevrubná analýza těchto modelů pomohla objasnit některé aspekty molekulární patogeneze Nethertonova syndromu a také role KLK5 a KLK7 v homeostázi kůže. Věříme, že tyto modely i v budoucnu přispějí k vývoji preparátů pro léčbu Nethertonova syndromu a pro další studium rolí KLK v živém organismu.
Abstract v angličtině:
Kallikrein-related peptidases (KLKs) constitute a family of closely related serine proteases encoded by genes clustered in one chromosomal locus. KLKs are widely expressed in a variety of tissues and numerous in vitro experiments suggest their important roles in many physiological and pathological processes. However, the biological roles of KLKs in vivo are often obscured mainly due to unavailability of suitable animal models. Although gene deficient mouse models were generated for several KLK genes, they had limited use for understanding the roles of individual proteases in the complex environment in vivo. One of the main obstacles which hampers in vivo analysis is partial functional overlap between some KLKs. This makes traditional single-gene deficient animal models an inadequate tool to address the biological impact of the gene deficiency as compensatory mechanisms often result in a lack of phenotype. In this work, we used the transcription activator-like effector nuclease (TALEN) technology to generate several novel mutant mouse models to study the complex KLK proteolytic pathways and their roles in healthy organism and in disease. We prepared a novel mouse model for Netherton syndrome (NS), an autosomal recessive skin disorder caused by mutation in the gene SPINK5, which encodes the KLK-inhibitor LEKTI. NS is associated with hyperactivity of KLKs, which results in the chronic inflammation of skin, hair defects and a severe disruption of skin barrier. By mimicking a patient- derived mutation of SPINK5 in mouse genome, we generated a mutant mouse that mimics the symptoms of NS patients and shows early post-natal lethality due to skin barrier failure. To address the roles of KLKs in the disease, we prepared a set of mutant mice individually or simultaneously deficient for KLK5 and KLK7 that were crossed with Spink5 mutants. We showed that although single ablation of KLK5 or KLK7 is not sufficient to rescue the lethal effect of LEKTI-deficiency, simultaneous inactivation of both KLKs completely rescues the epidermal barrier and the postnatal lethality allowing mice to reach adulthood with fully functional skin and normal hair growth. We also showed that both proteases KLK5 and KLK7 play important roles in the inflammation and defective differentiation in NS and KLK7 activity is not solely dependent on activation by KLK5. Furthermore, detailed analysis of KLK5/KLK7 double-deficient mice revealed prominent epidermal hyperkeratosis, which is the first in vivo evidence that both proteases are involved in the physiological process of shedding the epidermal cells from the skin surface. We also demonstrated that TALEN technology can be efficiently used to produce unconventional animal models in which only a portion of cells is characterized by ablation of targeted gene (genetic mosaics). Mosaic inactivation of Spink5 gene in mice generates a viable model for NS, which is characterized by patches of lesional skin that reproduces NS symptoms such as keratinocyte hyperproliferation, defective differentiation and alopecia. In contrast to traditional Spink5-deficient animals, Spink5-mosaics survive the neonatal period, which allows long term experiments, such as evaluation of therapeutic compounds. In summary, we have used the technology of programmable nucleases to generate several novel mouse models deficient for KLK proteases or their inhibitor LEKTI. Detailed analysis of these mice brought novel insights into the molecular pathogenesis of Netherton syndrome and also into the roles of KLK5 and KLK7 in skin homeostasis. We believe that these animal models will become useful tools for development of therapeutic compounds for NS treatment and for further characterization of KLK proteolytic pathways in vivo.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Bc. Petr Kašpárek 4.88 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Bc. Petr Kašpárek 69 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Bc. Petr Kašpárek 56 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Bc. Petr Kašpárek 488 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Mgr. Pavel Stopka, Ph.D. 88 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Ondřej Machoň, Ph.D. 217 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 729 kB