Výsledky projektu Studium intraproteinového/mezidoménového přenosu signálu u senzorových proteinů obsahujících hem, jmenovitě histidin kinasy (AfGcHK) a diguanylátcyklasy (YddV)

Jednou z důležitých charakteristik hemoproteinů je jak rychle mohou molekuly vyskytující se v blízkém okolí hemu nahradit ligandy vázané na tento kofaktor. V práci byla metodou ultrarychlé spektroskopie zkoumána dynamika senzorové domény proteinu YddV po fotodisociaci ligandu NO u mutantu Leu65Gly. Bylo zjištěno, že v případě, kdy se nachází v blízkosti hemu molekula vody (typicky u Leu65Gly), probíhá nahrazení ligandu NO molekulou vody mnohem rychleji (~ 4 ps) než je tomu např. u myoglobinu. YddV Leu65Gly je prvním systémem kde bylo možné studovat vzájemnou záměnu dvou ligandů současně přítomných v těsné blízkosti hemu.

V práci byla studována role klíčových aminokyselin v distální části hemu proteinu YddV metodikou časově rozlišené infračervené spektroskopie spojené s Fourierovou transformací. Pro studium byly použité mutantní proteiny Leu65Met, Leu65Tyr, Tyr43Ala, Tyr43Phe, Tyr43Trp a zkoumán vliv těchto změn na dynamiku proteinu po fotodisociaci molekuly CO. Byla prokázána důležitost Leu65 a Tyr43 pro vazbu a dynamiku ligandu v aktivním centru a i když je senzorová doména YddV podobná např. proteinu HemAT, vazba ligandů CO nebo O2 je velice odlišná. Hlavně konformační změny po disociaci ligandu jsou mnohem pomalejší u YddV, zatímco propionáty hemu se chovají po vazbě nebo disociaci ligandu velice podobně.

Souhrnný článek široce shrnující poznatky v oblasti hemových senzorových proteinů a velký prostor je věnován i oběma modelovým systémům, tj. AfGcHK a YddV.

Publikace se věnuje charakterizaci kinetických parametrů histidinkinázy AfGcHK. Byly určeny parametry jako Km(ATP), Vmax, kcat pro protein za různých podmínek a v různých koordinačních stavech iontu železa v hemu lokalizovaném v senzorové doméně [Fe(III)-OH, Fe(III)-CN, Fe(III)-Imidazol, Fe(II), Fe(II)-O2, Fe(II)-CO], bez hemového kofaktoru nebo v přítomnosti interakčního partnera RR. Rovněž byl studován vliv různých kationtů na enzymovou aktivitu proteinu. Z těchto kinetických parametrů pak byly vyvozeny i základní informace o struktuře a možném uspořádání celého modelového systému.

Práce se zabývá senzorovým proteinem EcDOS z bakterie E. coli, který je spolu s YddV odpovědný za regulaci hladiny c-di-GMP. I když studium tohoto proteinu nebylo hlavní náplní projektu GAUK, v naší laboratoři se jeho výzkumu také věnujeme a řešitel se v tomto případě podílel na některých experimentech. V práci byl studován vliv sulfidu sodného na katalytickou aktivitu proteinu EcDOS. Bylo pozorováno, že sulfid sodný zvyšuje aktivitu EcDOS a po jeho přidání dochází k tvorbě hexakoordinovaného komplex Fe(III)-SH a Fe(II)-O2. Studie jako prvá charakterizuje protein EcDOS v přítomnosti sulfidu sodného a popisuje jeho vliv na spektrální charakteristiky a katalytickou aktivitu.

Uvedená práce se zabývá vlivem mutace Leu65 (aminokyselina v těsné blízkosti hemu) na stabilitu hemu a komplexu hemu s kyslíkem v senzorové doméně proteinu YddV (kyslíkový senzor). Po mutaci této aminokyseliny v distální části hemu dochází místo vazby kyslíku (detekce) k degradaci hemového kofaktoru na verdohem a protein se tudíž chová podobně jako enzym hem oxygenasa (místo detekce kyslíku jej zabuduje do molekuly hemu). Přítomnost verdohemu byla detekována spektrofotometricky, pomocí hmotnostní spektrometrie a taky měřením množství produkce oxidu uhelnatého, který je meziproduktem při přeměně hemu na verdohem. Podstata uvedeného chování proteinu YddV spočívá ve funkci Leu65, který brání vstupu molekuly vody do aktivního centra senzorové domény a stabilizuje tak komplex hemu s kyslíkem. Po mutaci Leu65 je komplex hem-kyslík méně stabilní, dochází k nahrazeni vázaného kyslíku molekulou vody (ta se stává šestým ligandem místo kyslíku) a zárověn ke vzniku reaktivních forem kyslíku, které mohou degradovat hem na verdohem, případně biliverdin.

Práce se zabýva dvěma senzorovými proteiny YddV a EcDos. Aktivita fosfodiesterázy EcDos k cyklickému diGMP (c-diGMP) je regulována na základě redoxního stavu atomu železa v molekule hemu senzorové domény. Komplex Fe(II) je aktivnější vůči c-diGMP než Fe(III) komplex, a jeho aktivita je dále zvýšena vazbou O2 nebo CO. Pro určení vlivu redoxního stavu a koordinace atomu železa na katalytickou aktivitu EcDOS, jsme zkoumali flexibilitu izolované N-terminální hem-vázající domény (EcDOS-hem) sledováním spektrálních vlastností této domény při různých hydrostatických tlacích. Nejaktivnější forma Fe(II)-CO byla identifikována jako nejméně flexibilní. Naopak, oxidovaná forma Fe(III) a různé mutanty měly relativně vysoké flexibility, což se zdá být spojeno s nízkou katalytickou aktivitou intaktního enzymu. Tato zjištění potvrzují předpoklad odvozený z krystalografických dat o inverzním vztahu mezi flexibilitou senzorové domény obsahující hem a jeho katalytické aktivity. Data byla porovnána i s proteinem YddV, který funguje jako diguanylátcykláza.Bylo také zjištěno, že senzorová doména tohoto proteinu obsahující komplex Fe(II)-CO je rovněž velice rigidní. Přítomnost molekuly vody v těsném okolí hemu způsobena mutací zbytku Leu65 snižuje flexibilitu senzorové domény. Naopak, mutace další aminokyseliny v blízkosti hemu - Tyr43 flexibilitu zvýšila.