velikost textu

Výzkum látek s potenciálem chelatovat železo a jejich případné využití v terapii akutního infarktu myokardu

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Výzkum látek s potenciálem chelatovat železo a jejich případné využití v terapii akutního infarktu myokardu
Název v angličtině:
Screening of Iron-chelating Substances and their Potential Use in the Therapy of Acute Myocardial Infarction
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Tomáš Filipský, Ph.D.
Školitel:
Prof.MUDr. Radomír Hrdina, CSc.
Oponenti:
prof. RNDr. Jiří Patočka, DrSc.
doc. PharmDr. Martin Štěrba, Ph.D.
Konzultant:
PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D.
Id práce:
118610
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (P5206)
Obor studia:
Farmakologie a toxikologie (DFX4)
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
26. 9. 2013
Výsledek obhajoby:
prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Mgr. Tomáš Filipský Školitel: prof. MUDr. Radomír Hrdina, CSc. Konzultant: PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. Název disertační práce: Výzkum látek s potenciálem chelatovat železo a jejich případné využití v terapii akutního infarktu myokardu Železo je esenciálním elementem všech živých organismů. Za fyziologických podmínek je úroveň volného/nevázaného železa v organismu velmi nízká. V případě některých patologických stavů, je ovšem tato homeostáza železa narušena a může dojít k poškození orgánů v důsledku zvýšené tvorby reaktivních forem kyslíku. Ischemická choroba srdeční je celosvětově nejčastější příčinou morbidity a mortality. Její nejzávažnější formou je akutní infarkt myokardu (AIM). Již během časné ischémie se do krevního řečiště uvolňují katalyticky aktivní elementy, především zmíněné železo, ale také měď. Po obnovení krevního průtoku (reperfuzi) se mohou účastnit produkce biologicky nejnebezpečnějšího oxidantu – hydroxylového radikálu tzv. železem/mědí katalyzovanou Fentonovou reakcí. Tudíž se zde nabízí potencionálně aplikovatelný farmakoterapeutický přístup k léčbě tohoto onemocnění – terapie látkami chelatujících železo/měď. Cílem této disertační práce byl výzkum látek chelatujících železo a jejich vliv na isoprenalinový model AIM včetně charakterizace některých dříve nezkoumaných aspektů tohoto modelu. V in vitro části studie byla k analýze účinků testovaných látek při (pato)fyziologicky relevantních pH použita: 1) spektrofotometrická ferrozinová metoda k detekci účinnosti chelatace železa a 2) HPLC analýza k zjištění anti/pro-oxidační aktivity s použitím kyseliny salicylové jako indikátoru tvorby hydroxylového radikálu. Kromě toho byl vyvinut nový, finančně nenáročný, ale přesný analytický přístup pro zjištění stechiometrie komplexu chelátor:železo za využití UV–Vis spektrofotometrie. In vivo část studie byla zaměřena na zhodnocení vlivu dexrazoxanu (20,4 mg/kg, i.v.) na isoprenalinový model AIM (100 mg/kg, s.c.) u Wistar:Han potkanů. Kromě toho byly také popsány časné patologické změny a vzájemné vztahy mezi biochemickými markery a funkčními parametry srdeční dys/funkce po aplikaci isoprenalinu. V těchto in vivo studiích byla použita termodiluční metoda nebo invazivní měření tlaku a objemu v levé srdeční komoře. Pro chelatační účinky flavonoidů se jako nejvýhodnější pozice jevila 6,7-dihydroxylová skupina. Baikalein, obsahující tuto strukturu, měl srovnatelnou schopnost chelatovat železo jako referenční chelátor železa – deferoxamin. Nicméně jeho vliv na inhibici Fentonovy reakce byl menší. 3-hydroxy-4-keto substituce s dvojnou vazbou v poloze 2 a pyrokatecholový kruh B (např. kvercetin) byly rovněž spojeny s významnými chelatačními účinky. Na druhou stranu vliv těchto flavonoidů na Fentonovu reakci byl spíše minimální. V některých případech byl pozorován dokonce nežádoucí pro-oxidační účinek. Ačkoli mezi dlouho známé podskupiny syntetických chelátorů železa patří 1-fenyl-3-methyl-4-acyl- pyrazol-5-ony, poznatky týkající se jejich biologické aktivity jsou spíše limitované. Některé sloučeniny prokázaly vyšší účinnost při pH 4,5 než v klinické praxi používaný deferoxamin. Za zmínku stojí prototypová sloučenina H2QpyQ, tj. 2,6-bis[4(1-fenyl-3-methylpyrazol-5-on)karbonyl]pyridin, jejíž schopnost chelatovat železo rostla s klesajícím pH. Podle našich znalostí je to vůbec první sloučenina, která má takovéto vlastnosti. Kromě toho většina acylpyrazolonů patřila mezi velmi účinné inhibitory Fentonovy reakce, jež lze srovnávat s deferoxaminem. Jednou z důležitých vlastností chelátorů je i stechiometrie vytvořeného komplexu ve vztahu k pH. Jelikož je u některých látek, např. flavonoidů, stechiometrie komplexů stále nejasná, byl k jejímu určení vyvinut nový analytický přístup za využití UV–Vis spektrofotometrie. Hlavní výhodou oproti standardní Jobově metodě se jeví jeho schopnost určit stechiometrii a případně i kinetiku tvorby komplexu i u slabých chelátorů železa. Studie zaměřená na analýzu časných patologických změn po aplikaci kardiotoxické dávky isoprenalinu prokázala, že z patogenetického hlediska diastolická dysfunkce předchází systolické dysfunkci a že k její samotné indukci je stimulace pouze β2-adrenergních receptorů nedostatečná. Kromě toho sérové koncentrace srdečního troponinu (cTnT) významně korelovaly se závažností poškození myokardu u potkanů (např. s přetížením myokardu vápníkem – pozitivní korelace a tepovým objemem – negativní korelace). Na druhou stranu korelace cTnT s markery oxidačního stresu byly spíše nevýrazné (glutathion a vitamin C) nebo nulové (vitamin E a TBARS – reaktivní formy thiobarbiturové kyseliny, z angl. thiobarbituric acid reactive substances). Vztah mezi cTnT a dalšími parametry byl exponenciální s výjimkou koncentrace vápníku v srdeční tkáni, kde byl nalezen vztah, který popisuje mocninná funkce. V 24hodinovém experimentu podání dexrazoxanu vedlo k částečnému poklesu mortality, snížení koncentrace vápníku v srdeční tkáni, ke zlepšení histopatologického nálezu a hemodynamických parametrů. Kontinuální 2hodinový experiment prokázal, že dexrazoxan není schopen ovlivnit isoprenalinem navozené atrioventrikulární bloky a jeho vliv na hemodynamické parametry byl zde spíše minimální. Navíc in vitro experimenty naznačily, že chelatační vlastnosti dexrazoxanu nehrají významnou roli v kardioprotektivním mechanismu. Závěrem lze shrnout, že série in vitro experimentů může u chelátorů železa alespoň částečně predikovat pozitivní nebo i negativní vliv na isoprenalinový model AIM. Některé aspekty bude ale nutné ověřit v dalších zejména in vivo experimentech.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department: Department of Pharmacology and Toxicology Candidate: Mgr. Tomáš Filipský First supervisor: prof. MUDr. Radomír Hrdina, CSc. Second supervisor: PharmDr. Přemysl Mladěnka, Ph.D. Title of doctoral thesis: Screening of iron-chelating substances and their potential use in the therapy of acute myocardial infarction Iron is an essential element virtually for all living organisms. The concentration of free/unbound iron is very low at physiological conditions. However, in several pathological states, its homeostasis is impaired which may lead to an organ damage due to the increased production of reactive oxygen species. Coronary heart disease is the main cause of morbidity and mortality worldwide. Its most serious form is acute myocardial infarction (AMI). During the early ischaemia, catalytically active elements, particularly iron and copper, are released into the blood circulation. After restoration of blood flow (reperfusion), these elements may participate in the production of biologically the most potent oxidant – hydroxyl radical via iron/copper catalysed Fenton reaction. Therefore, a therapy based on administration of iron/copper-chelating agents could be a potential pharmacotherapeutic approach in the treatment of this disease. The main aim of this doctoral thesis was a screening of iron-chelating substances and their influence on isoprenaline model of AMI including characterisation of several previously unknown aspects of this model. In vitro study analysed effects of the tested substances at (patho)physiologically relevant pH conditions by: 1) the spectrophotometric ferrozine methodology detecting iron-chelating properties, and 2) the HPLC analysis determining anti/pro-oxidative activities by the use of salicylic acid as the indicator of the formation of hydroxyl radical. Moreover, a new inexpensive but precise analytical approach for a determination of a stoichiometry of the complex chelator:iron using UV–Vis spectrophotometry was evolved. In vivo part of the study was aimed at an evaluation of effects of dexrazoxane (20.4 mg/kg, i.v.) on isoprenaline model of AMI (100 mg/kg, s.c.) in Wistar:Han rats. Furthermore, early pathological changes and relationships among various biochemical and functional parameters of cardiac dys/function were described after the administration of isoprenaline. In these in vivo studies, the thermodilution method or the invasive measurement of pressure and volume in the left heart ventricle were used. In flavonoids, the 6,7-dihydroxy structure was the most effective substitution for iron-chelation. Baicalein, in which this group is incorporated, possessed a similar ability to chelate iron as a reference iron chelator deferoxamine. However, its influence on the inhibition of Fenton reaction was lower. The 3-hydroxy-4- keto conformation together with 2,3-double bond and the catecholic B ring (e.g. quercetin) were associated with a substantial iron-chelating properties as well. On the other hand, the influence of these structures on Fenton reaction was rather minimal, and in several cases, even undesirable pro-oxidative effect was observed. Although synthetic iron chelators from the group of 1-phenyl-3-methyl-4-acyl-pyrazol-5-ones have been known for many years, data on their biological activity are rather limited. Some of the tested substances were even more potent iron chelators at pH 4.5 than the clinically used standard – deferoxamine. Of particular interest is a prototype compound H2QpyQ, i.e. 2,6-bis[4(1-phenyl-3-methylpyrazol-5-one)carbonyl]pyridine, which iron-chelating affinity increased when pH was decreasing. To our knowledge, it is the first compound having such properties. Moreover, most of the tested acylpyrazolones were powerful inhibitors of Fenton chemistry as deferoxamine. One of the most important features of iron chelators is the stoichiometry of a formed complex in relation to pH. Moreover, in certain substances, e.g. flavonoids, the stoichiometry of the complex has been still unknown, therefore, a new analytical approach using UV–Vis spectrophotometry was evolved. The major benefit of this approach, compared to the standard Job’s method, seems to be its capability to reveal the stoichiometry and the kinetic aspects of formation of the complex in chelators with moderate affinity to iron, as well. The study focused on the analysis of early pathological changes after administration of the cardiotoxic dose of isoprenaline showed that diastolic dysfunction preceded systolic dysfunction and β2-adrenoreceptor stimulation alone was not sufficient for its induction. Moreover, serum concentration of cardiac troponin T (cTnT) correlated strongly with the degree of myocardial injury in rats (e.g. calcium overload – positive correlation, stroke volume – negative correlation). On the other hand, correlations between cTnT and oxidative stress parameters were weak (for glutathione and vitamin C) or were not found (for serum vitamin E and TBARS – thiobarbituric acid reactive substances levels). Relationships between cTnT and other parameters were exponential with the exception of myocardial calcium, where a power function was found. In a 24-hour experiment, the administration of dexrazoxane resulted in the partial decrease in mortality, reduction of myocardial calcium overload and improvement in histological impairment and peripheral haemodynamic disturbances. Continuous 2-hour experiments showed that dexrazoxane did not influence isoprenaline-induced atrioventricular blocks and had little effect on the measured haemodynamic parameters. Complementary in vitro experiments suggested that iron-chelating properties of dexrazoxane apparently did not play the major role in the cardioprotective mechanism. It can be concluded that in vitro analysis of iron chelators may at least partially predict their positive or even negative influence on isoprenaline model of AMI. On the other hand, some aspects should be confirmed by additional in vivo experiments.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Tomáš Filipský, Ph.D. 23.65 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Tomáš Filipský, Ph.D. 219 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Tomáš Filipský, Ph.D. 138 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Prof.MUDr. Radomír Hrdina, CSc. 262 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Jiří Patočka, DrSc. 763 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. PharmDr. Martin Štěrba, Ph.D. 232 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Doc. PharmDr. František Trejtnar, CSc. 608 kB