Metody založené na fluorescenci jednotlivých molekul - MC260P135

• Anglický název: Methods based on fluorescence of single molecules
• Český název: Metody založené na fluorescenci jednotlivých molekul
• Zajišťuje: Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
• Fakulta: Přírodovědecká fakulta
• Platnost: od 2019
• Semestr: letní
• E-Kredity: 3
• Způsob provedení zkoušky: letní s.:
• Rozsah, examinace: letní s.:2/0, Zk [HT]
• Počet míst: neomezen
• Minimální obsazenost: neomezen
• 4EU+: ne
• Virtuální mobilita / počet míst pro virtuální mobilitu: ne
• Stav předmětu: vyučován
• Jazyk výuky: čeština
• Poznámka: povolen pro zápis po webu
• Garant: doc. RNDr. Radek Šachl, Ph.D.
• Vyučující: doc. RNDr. Radek Šachl, Ph.D.

Anotace

čeština

Poslední úprava: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)

Fluorescenční spektroskopie založená na detekci jednotlivých molekul (single molecule fluorescence
spectroscopy) zažila v nedávné době nebývale rychlý rozvoj a stala se tak jednou z nepostradatelných
metod v oblasti biofyziky. Cílem tohoto kurzu je teoreticky seznámit posluchače s tímto oborem. Důraz je
kladen především na porozumění fyzikálně-chemických principů, na nichž jsou tyto metody založeny.
Užitečnost těchto fluorescenčních technik je demonstrována na mnoha praktických příkladech z oblasti
biofyziky.

angličtina

Poslední úprava: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)

Single molecule fluorescence spectroscopy has recently experienced unprecedented rapid development
and has become one of the indispensable methods in biophysics. The aim of this course is to make
students familiar with this field. Emphasis is placed on understanding the physico-chemical principles on
which these methods are based. The usefulness of these fluorescence techniques is demonstrated on many
practical examples from the field of biophysics.

Literatura

čeština

Poslední úprava: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)

Doporučená literatura
1. J. R. Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, Springer, 3rd edn., 2006.
2. B. Valeur, Molecular Fluorescence Principles and Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH, New
York, 2001.

angličtina

Poslední úprava: doc. RNDr. Radek Šachl, Ph.D. (24.05.2019)

1.  J. R. Lakowicz, Principles of fluorescence spectroscopy, Springer, 3rd edn., 2006.

2.  B. Valeur, Molecular Fluorescence Principles and Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH, New York, 2001.

Požadavky ke zkoušce

čeština

Poslední úprava: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)

Ústní zkouška v rozsahu přednášené látky

angličtina

Poslední úprava: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)

Oral exam covering the sylabus

Sylabus

čeština

Poslední úprava: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)

1) Úvod do fluorescence: Jablonskiho diagram; absorpční a emisní spektra; fluorescenční značky;
kinetika vyhasínání; fluorescenční decay; průměrná doba života; kvantový výtěžek fluorescence;
zhášení fluorescence;
2) Detekce jednotlivých molekul: principiální rozdíly vůči klasickému měření fluorescence ze souboru
mnoha molekul; fotofyzika jednotlivých molekul; metody detekce fluorescence; konfokální versus

wide-filed mikroskop; metoda TIRF (total internal reflection fluorescence); detekce různých
proteinových konfigurací pomocí sm-FRET techniky; rotace a reorientace jednotlivých molekul;
3) Stopování jednotlivých molekul (Single particle tracking, SPT): difúze ve dvou rozměrech; náhodná
procházka; MSD diagramy; různé módy difúze: volná, ‚hindered‘ a hop-difúze. Metody měření SPT;
odvozené techniky: analýza svítivosti a TOCCSL (thining out clusters while conserving stochiometry
of labelling); kolokalizační analýza
4) Fluorescenční korelační kroskorelační spektroskopie (FCS a FCCS) I: teorie FCS: autokorelační a
kroskorelační funkce; translační difúze v FCS; inter-system crossing v FCS;
5) FCS a FCCS II: FCS ve dvou dimenzích: aplikace na membrány; FLCS technika; praktické aplikace
FCS: reakční kinetika, vázání proteinů na membránu, klastrování proteinů na membráně;
6) PCH – photon counting histogram: principy a aplikace v biofizice; shot noise; Number and brightness
metoda (N&B); fluorescence antibunching;
7) Depolarizace fluorescence: definice anisotropie; metody její detekce; excitační a emisní anisotropická
spektra; důvody depolarizace fluorescence; kinetika vyhasínání anisotropie; efekty rotační difúze na
fluorescenční anisotropii;
8) Försterův přenos energie (hetero-FRET): FRET v rámci jednoho donor-akceptorového páru; migrace
enegie mezi dvěma donory (homo-FRET); kinetika vyhasínání fluorescence a anisotropie; single
molecule FRET
9) Försterův přenos a migrace energie v poli mnoha donorů a akceptorů: kinetika vyhasínání
fluorescence v poli mnoha akceptorů, FRET na lipidové dvojvrstvě, určení šířky lipidové dvojvrstvy;
MC-FRET; detekce lipidových nanodomén; oligomerizace proteinů na membráně – kvantifikace
pomocí homo- a hetero-FRETu
10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) a Imaging-FCS: Principy a praktické aplikace

angličtina

Poslední úprava: doc. RNDr. Iva Zusková, CSc. (23.05.2019)

1) Introduction into fluorescence: Jablonski diagram; absorption and emission spectra; fluorescent
probes; kinetics of fluorescence deexcitation; fluorescence decay; average fluorescence lifetime;
quantum yield of fluorescence; fluorescence quenching;
2) Detection of individual molecules: principal differences between a classical fluorescence
measurements from a large ensemble of molecules and a single molecule fluorescence measurement;
photophysics of individual molecules; methods of fluorescence detection; confocal versus wide-filed
microscope; total internal reflection fluorescence (TIRF); detection of different protein configurations
by sm-FRET; rotations and reorientations of individual molecules;

3) Single particle tracking (SPT): diffusion in two dimensions; random walk; MSD diagrams; different
modes of diffusion: free, hindered and hop-diffusion. Methods of SPT measurement; Derived
Techniques: brightness analysis and TOCCSL (thinning out clusters while conserving stoichiometry
of labeling); colocalization analysis
4) Fluorescence correlation and cross-correlation spectroscopy (FCS and FCCS) I: theory of FCS:
autocorrelation and cross-correlation functions; translational diffusion in FCS; inter-system crossing
in FCS;
5) FCS and FCCS II: FCS in two dimensions: applications to lipid membranes; FLCS technique;
practical applications of FCS: reaction kinetics, protein binding to the membrane, clustering of
proteins on the membrane;
6) PCH - photon counting histogram: principles and applications in biophysics; shot noise; Number and
brightness method (N&B); fluorescence anti-bunching;
7) Fluorescence depolarization: definition of anisotropy; measurement of anisotropy; excitation and
emission anisotropic spectra; causes of fluorescence depolarization; kinetics of fluorescence
depolarization; rotational diffusion and its impact on fluorescent anisotropy;
8) Förster resonance energy transfer (hetero-FRET): FRET within one donor-acceptor pair; migration of
energy between two donors (homo-FRET); kinetics of fluorescence deexcitation and depolarization;
single molecule FRET
9) Förster resonance energy transfer and migration in the field of many donors and acceptors:
fluorescence deexcitation kinetics in the field of many acceptors, FRET on lipid bilayer,
determination of the thickness of a lipid bilayer; MC-FRET; detection of lipid nanodomains;
oligomerization of proteins on the membrane - quantification using homo- and hetero-FRET
10) Raster Image Correlation Spectroscopy (RICS) and Imaging-FCS: Principles and practical
applications