Cytometrie - MB151P80

• Anglický název: Cytometry
• Český název: Cytometrie
• Zajišťuje: Katedra buněčné biologie (31-151)
• Fakulta: Přírodovědecká fakulta
• Platnost: od 2015 do 2015
• Semestr: letní
• E-Kredity: 4
• Způsob provedení zkoušky: letní s.:
• Rozsah, examinace: letní s.:2/1, Z+Zk [HT]
• Počet míst: 40
• Minimální obsazenost: neomezen
• 4EU+: ne
• Virtuální mobilita / počet míst pro virtuální mobilitu: ne
• Stav předmětu: vyučován
• Jazyk výuky: čeština
• Vysvětlení: Předmět je neslučitelný se Základy cytometrických metod - MB130P75(základní přednášky jsou pro oba předměty shodné).Prosím, přihlašte se do Moodle kurzu (e-learning) vpravo
• Poznámka: povolen pro zápis po webu
• Garant: RNDr. Karel Drbal, Ph.D.
• Vyučující: prof. Ing. Jaroslav Doležel, DrSc.; RNDr. Karel Drbal, Ph.D.; prof. MUDr. Tomáš Kalina, Ph.D.

Anotace

Poslední úprava: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (05.03.2018)

Předmět je jedním ze speciálních technologických kurzů, které na PřF UK probíhají včetně praktických cvičení.
Navazuje na předměty:
- Fluorescenční mikroskopie v buněčné biologii - MB151P96
- Mikroskopická technika - MB160C45
a je neslučitelný s paralelně probíhajícím předmětem (bez praktických cvičení):
- Základy cytometrických metod - MB130P75.
Základní přednášky J. Doležela jsou společné pro oba předměty.

Budete provedeni základní klasifikací cytometrických metod s jejich historickým kontextem. Technologické výhody a nevýhody jednotlivých vývojových směrů cytometrie budou dokumentované na aplikacích ve více oborech: botanice, mikrobiologii, protistologii, hydrobiologii, molekulární biologii, genetice, imunologii a biomedicíně obecně. Součástí jsou i praktická cvičení ve 4 tematických celcích (á 3 hodiny):
- design experimentu
- příprava vzorku a měření multiparametrických dat
- analýza dat (základní)
- analýza dat (pokročilá)

Aplikační využití cytometrie zahrnuje široké vědecké postupy a experimenty: analýzu a třídění různých velikostí částic od submikronových (chromozomů, bakterií, organel a vesiklů) přes buňky do velikosti stovek mikronů, ale i celých organismů až do velikosti 1mm. Analýza se neomezuje pouze na statické jednoparametrické "screeningové" experimenty, ale hlavní síla cytometrie je v multiparametrické analýze heterogenních vzorků a jejich funkčních vlastností. S objevem nových fluorochromů, včetně různých variant fluorescenčních proteinů, dnes můžeme studovat funkční projevy buněk až na úrovni protein-protein interakcí.
Vlastní cytometry i cytometrická data jsou velmi komplexní, plně standardizované a umožňují nám použití robustních statistických metod pro jejich analýzu. Součástí předmětu je proto praktická ukázka a detailní procvičení analýzy dat. Důraz klademe hlavně na průtokovou cytometrii. Další varianty cytometrie, včetně obrazové, budou probírané, ale nebudou předmětem vlastních praktických cvičení.

Absolventi budou mít po složení zápočtu a zkoušky:
- znalost principů jednotlivých směrů cytometrie
- znalost o funkci přístrojů a souvisejícím využití vhodných fluorochromů a prób
- znalost o stávajících aplikacích průtokové cytometrie v širokém spektru vědních oborů
- schopnost posoudit vhodnost zvolené metody při řešení konkrétního problému
- schopnost analyzovat a interpretovat výsledky získané průtokovou cytometrií
- schopnost kriticky hodnotit kvalitu cytometrických dat ve vědeckých publikacích

Literatura

Poslední úprava: RNDr. Nataša Šebková, Ph.D. (21.02.2018)

Pro začátečníky:
GIVAN, Alice. L.: Flow Cytometry: First Principles, Wiley-Liss, New York, 2001, ISBN-13: 978-0471382249
ORMEROD, Michael. G.: Flow Cytometry - A Basic Introduction, online version

Pro středně pokročilé:
DARZYNKIEWICZ, Zbygniew et al.: Methods In Cell Biology, Vol. 103: Recent Advances in Cytometry, Part A, Academic Press, Amsterdam, 2011.
DOLEŽEL, Jaroslav et al.: Flow Cytometry with Plant Cells. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007, ISBN-13: 978-3527314874

Pro experty:
SHAPIRO, Howard. M.: Practical Flow Cytometry, 4th Edition. John Wiley and Sons, Inc., New York, 2003, ISBN-13: 978-0471411253, dostupný @ Beckman Coulter webu nebo na Vašem mobilu
Coursera: MOUNT SINAI Experimental Methods in Systems Biology

Metodické učebnice a návody, včetně webinářů:
ROBINSON, J. Paul. et al.: Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, New York, 2003, ISBN-13: 978-0471142959
Chromocyte web obsahuje mnoho informačních zdrojů: https://www.chromocyte.com/educate/Beginners-Guide-Training-Resources

Požadavky ke zkoušce

Poslední úprava: RNDr. Karel Drbal, Ph.D. (06.10.2018)

Zkouška se sestává ze:
1/ povinného zápočtu za praktické provedení jednoho ze standardních experimentů, jeho analýzy a dokumentace ve formátu reportu - provádí se během praktických cvičení = max. 35 bodů

2/ návrhu Vašeho experimentu, včetně volby fluorochromů a prób, způsobu analýzy dat a popisu očekávaných výsledků
(styl malého projektu) = max. 50 bodů

3/ volitelného zpracování Wikipedického hesla v češtině na téma související s cytometrií, včetně 3-5 vhodných citací = max. 15 bodů

Každá část zkoušky je hodnocená samostatně a součet bodů je potom vyhodnocený na škále:

• 80 - 100 bodů = 1
• 60 - 79 bodů = 2
• 40 - 59 bodů = 3
• < 39 bodů = 4

U hraničních výsledků (75 - 79, 55 - 59, 35 - 39) bude provedeno ústní přezkoušení.

Sylabus

Poslední úprava: RNDr. Nataša Šebková, Ph.D. (21.02.2018)

Předmět Cytometrie je vyučován ve 4 cyklech, kdy v každém z nich je série 3 dvouhodinových přednášek (1,5 hodiny čistého času - pátek 14,50-16,20) vždy zakončená jedním praktickým 3-hodinovým cvičením (2 a 1/4 hodiny čistého času - pátek 16,30-18,45), a to ihned po poslední přednášce v dané sérii.

1. cyklus: Základy cytometrie - společné s předmětem Základy cytometrických metod - MB130P75:

PŘEDNÁŠKY:

1. Základy cytometrické technologie - termíny a kus historie (J. Doležel)
Klasifikace cytometrických technik, cytomika. Průtoková cytometrie, historie, parametry měřitelné pomocí průtokové cytometrie, základní části průtokového cytometru. Fluidika, laminární proudění, průtoková komůrka, hydrodynamická fokusace, principy sortingu.

2. Elektronika a optika cytometrů, metodiky třídění částic (J. Doležel)
Zdroje světla, rtuťové výbojky a lasery, optické filtry. Detekce světelných pulzů, fotodiody a fotonásobiče, parametry světelného pulzu. Zesilovače signálu, digitální zpracování signálů, kompenzace fluorescence, typy zobrazení výsledků analýzy. Cytometrické třídění, používaná konstrukční řešení a aplikace třídění (sorting).

3. Základy aplikací průtokové cytometrie - fokus na rostliny (J. Doležel)
Úvod do analýzy dat - obsah jaderné DNA, stanovení ploidie, určení velikost jaderného genomu, identifikace mezidruhových hybridů, detekce aneuploidie, určení způsobu reprodukce, analýza kinetiky buněčného cyklu, apoptóza, endoreduplikace, třídění buněčných jader a mitotických chromozómů, analýza protoplastů, analýza chloroplastů, analýza genové exprese, studium fytoplanktonu, fytopatologie.

PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Základy praktické analýzy dat
What you see is what you get: kvalita dat, datové standardy, rozlišení a distribuce dat, základní způsoby zobrazování, představení open source SW pro základní způsob analýzy (Flowing Software, Summit, WinMDI), komplexní SW balíky (SW: FlowJo, BC Kaluza, BD DiVa).

 

2. cyklus: Základní cytometrické aplikace

PŘEDNÁŠKY:

4. Použití cytometrie v  biotechnologiích a v biomedicíně (K. Drbal)
Malé fluorochromy, tandemy, FRET a fluorescenční proteiny.
Selekční metody producentů v biotechnologiích, environmentální analýza, vazba na -omics metodiky.
Imunofenotypizace buněk a tkání: imunitní odpověď, nádory, infekce, mikrovesikly/mikropartikule.

5. Funkční testy v experimentu (K. Drbal)
Apoptóza, proliferace, signalizace, mitochondrie a apoptóza, membránový potenciál, fluorescenční přenos energie (FRET), senzory, proby...

6. Cytometrické metody ve virologii, mikrobiologii, hydrobiologii, protistologii a ekologii (K. Drbal)

PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Design experimentu
Návrh experimentu a limity cytometrické metodiky (statistika v pozadí - rare cell, autofluorescence, kompenzace, základy kombinací fluorochromů, design panelů protilátek) a teorie vlastní přípravy vzorku (pevné tkáně, bakterie, kvasinky, viry, biosafety regulace)

 

3. cyklus: Cytometrické aplikace v klinice

PŘEDNÁŠKY:

7. Standardní cytometrická diagnostika v onkologii (E. Mejstříková/T. Kalina)
Ontogeneze a onkogeneze - krvetvorba a leukémie, kmenové buňky, stratifikace onkologických pacientů.

8. Funkční studie imunitního systému a kuličková proteomika v klinice (T. Kalina)
Ag-specifické T lymfocyty, sekrece cytokinů - multiplexová analýza, fosforylace kináz, ...

9. Standardizace přístrojů a dat - klinická cytometrie budoucnosti (V. Kanderová/T. Kalina)
EUROFLOW, multispektrální a hmotnostní cytometrie, alternativy klasického flow sortingu v klinice.

PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Příprava vzorku a měření multiparametrických dat
Příprava osmibarevného panelu monoklonálních protilátek dle doporučení EUROFLOW, značení a měření vzorku krve na 18-detektorovém cytometru BD LSR II, zpracování reportu (do poslední praktické hodiny)

 

4. cyklus: Cytometrická budoucnost 

PŘEDNÁŠKY:

10. Nové technologie v cytometrii (K. Drbal)
Mikrofluidika, fluorescenční próby, obrazová cytometrie, ...

11. Sortování a jeho nové aplikace v různých disciplínách (T. Kalina/K. Drbal)
Alternativy sortování v klinické praxi, sortování producentů v biotechnologiích, ...

12. Pokročilá analýza dat a pokročilé nástroje multivariantní analýzy se zaměřením na open source - CytoBank, CytoSpec, Plate Analyzer, R flow packages (K. Fišer/T. Kalina/K. Drbal)

PRAKTICKÉ CVIČENÍ: Práce s vašimi daty, multivariantní analýza dat, vizualizace velkých dat - troubleshooting